肝細胞膜轉運蛋白Mrp2對頭孢哌酮藥動學影響初探.pdf

1、目的：1.建立內(nèi)/外源性膽汁淤積大鼠模型，獲得表達不同水平Mrp2的大鼠模型；
　　 2.研究頭孢哌酮(Cefoperazone，CPZ)在內(nèi)/外源性膽汁淤積大鼠模型體內(nèi)的藥動學行為；
　　 3.初步闡明分布于肝臟的多藥耐藥相關蛋白2(Multidrug resistance associatedprotein2，Mrp2)對CPZ藥動學的影響。
　　 方法：1.內(nèi)源性膽汁淤積大鼠模型的建立：Wistar大鼠頸部

2、皮下注射苯甲酸雌二醇(Estradiol Benzoate，EB，11 mg/kg/d)，連續(xù)注射4 d可得；外源性膽汁淤積大鼠模型的建立：實驗前Wistar大鼠禁食12 h，經(jīng)乙醚麻醉后，迅速固定，上腹正中切口(約3 cm)開腹，暴露肝門，游離膽總管，用眼科剪于膽總管中上1/3處剪“V”字形口，插入引流管(腰麻管)，0號手術線雙重結扎固定引流管，鈍性分離大鼠腹部皮下隧道至頸部，開口，引流管過皮下隧道至頸外固定，遠端結扎5d，于第6 d

3、再通(即剪開引流管遠端結扎處)，再通3 d后獲得外源性膽汁淤積大鼠模型。
　　 2.CPZ的藥動學研究：將Wistar大鼠分為正常對照組，內(nèi)源性膽汁淤積模型組；溶媒對照組(皮下注射等體積的橄欖油)；外源性膽汁淤積模型組；假手術組(大鼠被開腹，游離膽管后關腹)；灌胃茵梔黃顆粒3 d/7 d內(nèi)源性膽汁淤積組；灌胃生理鹽水3 d/7 d內(nèi)源性膽汁淤積模型組；灌胃茵梔黃顆粒7 d外源性膽汁淤積組；灌胃生理鹽水7 d外源性膽汁淤積模型組。

4、各組大鼠在給予CPZ前進行膽管插管術(外源性膽汁淤積模型組除外)和股動脈插管手術，待大鼠恢復清醒狀態(tài)后，通過股靜脈給大鼠瞬間注射CPZ生理鹽水溶液(20 mg/Kg)，采集不同時間點的血樣、收集不同時間段的膽汁，用含有內(nèi)標的葛根素甲醇溶液(20μg/mL)沉淀蛋白。采用Cosmosil Ci8色譜柱(5μm，4.6×150 mm)，以甲醇-0.03 mol/L醋酸銨緩沖液(20∶80 v/v)為流動相，流速1 mL/min，檢測波長為2

5、70nm，柱溫40℃，進樣量10μL的色譜條件測定CPZ在大鼠膽汁和血液中的濃度，并用DAS1.0軟件估算相應的藥動學參數(shù)。
　　 結果：1.內(nèi)/外源性膽汁淤積大鼠模型的進食量，體重及活動量均明顯減少，且其生化指標谷草轉氨酶(Glutamic oxaloacetic transaminase，AST)、谷丙轉氨酶(Glutamic pyruvic transaminase，ALT)、總膽紅素(Total bilirubin，TB

6、IL)、直膽紅素(Direct bilirubin，DBIL)、總膽汁酸(Total bile acids，TBA)及堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)顯著升高，而白蛋白(Albumin，ALB)和膽固醇(Cholesterol，CHOL)顯著降低。外源性膽汁淤積大鼠模型的雙耳、眼球及尾巴均明顯黃染，尿液變黃，其肝臟腫脹，包膜張力變大，邊緣鈍厚，色澤暗紅，其組織病理切片可見毛細膽管擴張，肝血竇變窄，匯管區(qū)毛細

7、膽管大量增加等現(xiàn)象，再通手術后，其肝臟組織漸漸恢復正常，但有個別大鼠的肝組織出現(xiàn)了局部硬化的現(xiàn)象。內(nèi)源性膽汁淤積大鼠模型未見雙耳、眼球和尾巴的黃染，但尿液變黃，其肝臟腫脹并黃染，有淤血現(xiàn)象，且組織病理切片可見肝內(nèi)膽管有所增生，肝細胞排列紊亂，小葉間質炎癥等現(xiàn)象。
　　 2.CPZ的血漿樣品和膽汁樣品在0.16～160μg/mL濃度范圍內(nèi)的標準線性方程分別為Y=0.1703X+0.0019和Y'_0.1404 X'+0.0011，

8、其相關系數(shù)R2分別為0.9993和0.9996；血漿樣品的日內(nèi)、日間回收率均大于92.42％，精密度RSD均小于9.55％；膽汁樣品的日內(nèi)、日間回收率均大于91.22％，精密度RSD均小于8.06％。
　　 3.CPZ在內(nèi)/外源性膽汁淤積大鼠模型體內(nèi)的藥動學行為較正常大鼠組發(fā)生了顯著變化，其在內(nèi)/外源性膽汁淤積大鼠模型體內(nèi)的血藥濃度顯著增加而膽藥濃度顯著降低(P＜0.01)，且CPZ在內(nèi)/外源性膽汁淤積大鼠體內(nèi)經(jīng)膽汁排泄的量較正

9、常大鼠分別降低28.58％和59.23％，而其半衰期t1/2和平均滯留時間(Meanresidence time，MRT)顯著增加(P＜0.01)，而系統(tǒng)清除率(Systemic clearance，CLsys)和膽汁清除率(Bile clearance，CLbile)顯著降低(P＜0.01)。
　　 4.CPZ在茵梔黃顆粒治療7 d的內(nèi)源性膽汁淤積大鼠模型體內(nèi)的動力學行為與灌胃7 d生理鹽水內(nèi)源性膽汁淤積大鼠模型的藥動學學行為

10、存在顯著性差異，其t1/2分別為0.385±0.016 h和0.526±0.17 h(P＜0.01)；其MRT分別為0.472±0.098 h和0.6530.131 h(P＜0.01)。但CPZ在茵梔黃顆粒治療7 d的外源性膽汁淤積大鼠模型體內(nèi)的藥動學行為與灌胃7 d生理鹽水外源性膽汁淤積大鼠模型的藥動學行為間并無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論：1.本實驗通過大鼠頸部皮下注射EB和膽道梗阻-再通手術分別獲得了典型的內(nèi)/

11、外源性膽汁淤積大鼠模型。
　　 2.肝細胞膜轉運蛋白Mrp2在膽汁淤積大鼠模型肝臟上的表達顯著降低，使CPZ不能被順利排入膽汁，導致了CPZ在膽汁淤積大鼠體內(nèi)經(jīng)膽汁排泄的量顯著降低，在血液循環(huán)中的濃度顯著升高，使系統(tǒng)清除率也隨之降低。
　　 3.茵梔黃顆粒作為臨床上常用的治療黃疸的輔助用藥，灌胃給予內(nèi)/外源性膽汁淤積大鼠模型7d后，根據(jù)CPZ的藥動學行為變化初步推測茵梔黃顆粒的退黃作用機制之一可能是改變了Mrp2的表達或