核黃素轉(zhuǎn)運基因C20orf54多態(tài)變異與食管癌高發(fā)病風險.pdf

1、1、研究背景和目的
　　 食管癌是世界上最常見的六大惡性腫瘤之一。中國，尤其是河南、河北和山西三省交界的太行山地區(qū)，是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)之一。明顯的家族聚集現(xiàn)象是食管癌流行病學的突出特征之一。顯著的地域性分布差異和明顯的家族聚集現(xiàn)象提示環(huán)境和遺傳因素在食管癌發(fā)生中可能起重要作用。近年的研究提示，遺傳和環(huán)境因素交互作用可能是導致食管癌變的重要機制。但由于缺乏對人群大樣本遺傳變異檢測的高通量技術(shù)，有關(guān)遺傳變異和食管

2、癌變關(guān)系尚不十分清楚。
　　 2007年問世的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GenomeWideAssociationStudy,GWAS)技術(shù)很快被應用于惡性腫瘤等許多復雜性疾病易感基因的定位研究。并被認為是目前確定復雜性疾病遺傳易感基因最有效的方法之一。GWAS技術(shù)的特點是高通量遺傳變異檢測（一次可檢測50-100萬個SNPs，SingleNucleitidePolymorphism）和強大的統(tǒng)計分析功能。
　　 本課題組利用G

3、WAS技術(shù)進行中國人群食管癌易感基因定位研究，發(fā)現(xiàn)C20orf54（又稱核黃素轉(zhuǎn)運基因，humanriboflavintransporter2，hFRT2）基因是食管癌重要的易感基因之一。hFRT2位于20號染色體，編碼人核黃素轉(zhuǎn)運蛋白2，細胞系和動物實驗研究提示C20orf54的作用是將核黃素從細胞外轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)。老一代科學家對河南食管癌高發(fā)區(qū)的研究已證實核黃素缺乏是食管癌發(fā)生的重要危險因素之一。膳食補充核黃素能明顯降低食管癌的患病風

4、險。但是膳食補充核黃素所引起的干預效果存在明顯的個體差異。C20orf54的變化可能在一定程度上解釋了這種個體差異的分子基礎(chǔ)。如果C20orf54基因變異，失去這種轉(zhuǎn)運功能，即使補充核黃素也因為不能有效進入細胞內(nèi)而失去干預的效果。很顯然，進一步了解C20orf54基因的變化特征及其與核黃素水平關(guān)系，對揭示環(huán)境和遺傳因素交互作用對食管癌變影響的分子基礎(chǔ)和個體化防治等具有重要意義。
　　 SNP是指在基因組水平上因單個核苷酸變異而引

5、起的DNA序列多態(tài)性，是人類可遺傳的變異中最常見的一種。位于基因編碼區(qū)內(nèi)的SNP(codingSNP，cSNP)較少，但它在與遺傳有關(guān)疾病的研究中具有重大意義。本研究組食管癌GWAS研究確定C20orf54基因上一個重要SNP位點，這是一個重要的標簽，提示該位點前后可能還存在其他與核黃素轉(zhuǎn)運相關(guān)的變異位點。進一步對這一基因區(qū)域進行深度測序?qū)﹃U明C20orf54基因不同變異類型具有重要意義。
　　 需要指出的是，移民流行病學研究可

6、能是揭示環(huán)境和遺傳因素交互作用對食管癌發(fā)生影響的最佳模型之一。本研究組對河南食管癌高發(fā)區(qū)林州遷徙居民（＞100年）病理流行病學研究發(fā)現(xiàn)這些移民食管癌發(fā)病率與遷徙地居民相似。因此，對比分析這些遷徙居民與當?shù)鼐用窈它S素水平及C20orf54基因變異對進一步確立食管癌個體化防治新的研究思路和方向等具有重要意義。
　　 本研究在前期工作基礎(chǔ)上，通過檢測長治地區(qū)正常人群、食管癌人群和長治林州移民血漿中核黃素水平及下常食管黏膜組織和鱗癌組織

7、中核黃素水平，研究C20orf54基因中SNPs(rs3746804，rs3746803，rs3746802)與食管癌的遺傳易感性，旨在揭示遺傳與環(huán)境的相互作用關(guān)系，建立食管癌高危人群篩查的生物指標，為食管癌的個體化防治提供科學依據(jù)。
　　 2、材料及方法
　　 2.1、血清核黃素水平測定
　　 2.1.1、研究對象和血樣采集
　　 研究對象分為三組:①對照組:選擇2008年6月-2010年9月于長治醫(yī)學

8、院附屬和平醫(yī)院行胃鏡檢查并證實無食管、賁門和胃粘膜癌變的健康人群，共689例，其中男性530例（平均年齡:56.9±7.3歲），女性159例（平均年齡:58.1±5.8歲）:②食管癌組:經(jīng)病理為食管鱗癌的患者，共445例，其中男性362例（平均年齡:57.3±5.9歲），女性83例（平均年齡:56.9±8.7歲），（所有患者均非林州移民或其后裔）;③林移組:居住于長治縣林移村的河南省林州市健康移民人群，共347例，其中男性270例（平均

9、年齡:55.6±9.3歲），女性77例（平均年齡:54.1±8.9歲）。
　　 血樣采集:上述人群均采集5ml空腹靜脈血樣，并于-40℃冰箱保存。
　　 2.1.2、研究方法
　　 提取人群血樣DNA，采用酶聯(lián)免疫吸附法，檢測對照組、食管癌組和健康林移組人群血漿中核黃素水平。ELISA試劑盒（人維生素B2酶聯(lián)免疫分析試劑盒）購自R&D公司。
　　 2.2、組織核黃素水平測定
　　 2.2.1、研究

10、對象和組織收集
　　 研究對象分為兩組:①對照組:選擇2010年9月-2011年2月于長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院行胃鏡檢查并證實無食管、賁門及胃粘膜病變的健康人群，共289例，其中男性177例（平均年齡:57.1±6.8歲），女性112例（平均年齡:58.1±7.9歲）;②食管癌組:選擇2009年8月-2011年4月于長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院住院并經(jīng)病理證實為食管鱗癌的患者，共250例，其中男性142例（平均年齡:58.3±5.2歲）

11、，女性108例（平均年齡:57.3±6.4歲）。
　　 組織采集:為食管癌手術(shù)切除標本。①食管癌組:為肉眼觀察壞死組織較少、黏膜尚完整的癌塊組織;②對照組:癌組織5cm外、經(jīng)病理切片證實無癌變的食管黏膜組織。所有標本以銳刀切取，包括食管全層:黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層，于-80℃冰箱保存。
　　 2.2.2、研究方法
　　 將組織標本從-80℃冰箱中取出，電子天平上稱取各標本100mg（包括對照組和食管癌組）

12、，加10mMPBS溶液1mL，組織勻漿儀充分勻漿后，將勻漿倒入離心管中離心20min，2000r/min，取上清200μL備用。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，按照HumanVB2ELISAKit試劑盒操作步驟檢測各組組織中核黃素水平。
　　 2.3、C20orf54基因中三個SNP位點與食管癌遺傳易感性
　　 2.3.1、研究對象及血樣采集
　　 研究對象分為兩組:①對照組:選擇2008年6月-2010年9月

13、于長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院行胃鏡檢查并證實無食管、賁門及胃粘膜癌變的健康人群，共198例，其中男性130例（平均年齡:57.4±5.3歲），女性68例（平均年齡:56.9±6.1歲）;②食管組:經(jīng)病理證實為食管鱗癌的患者，共240例，其中男性159例（平均年齡:57.9±7.6歲），女性81例（平均年齡:58.5±9.1歲）。病例資料內(nèi)容詳細包括性別、年齡、吸煙史、血型、體質(zhì)指數(shù)、抽煙飲酒史和家族史。
　　 血樣采集:上述人群均采

14、集5ml空腹靜脈血樣，-40℃冰箱保存。
　　 2.3.2、研究方法
　　 從分子水平上探討“C20orf54基因型→核黃素水平（血漿及組織）→食管黏膜病變（正常黏膜、癌前病變）→食管癌發(fā)生”的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與食管癌變相關(guān)的錯義cSNP位點。
　　 C20orf54基因共有9個錯義cSNP位點(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?geneId=11

15、3278)，我們對其中7個SNP位點的初步實驗結(jié)果顯示:食管癌患者中有3個位點檢測存在SNP錯義(mRNApos1139、1172、1246)，以1139和1172位點出現(xiàn)的頻率最高。
　　 采用Promega公司的Maxwell(R)16System及試劑盒提取全血中基因組DNA。以提取出來的全基因組DNA為模板，擴增C20orf54基因的3號外顯子(含有三個cSNP位點-mRNAPOS，1139，1172，1246)，由上海

16、生工生物有限公司合成引物如下:
　　 上游5'GGAGTTCCCAGAGCTTTGGTGTCCG3'
　　 下游5'CATAGGACAGGCAGGAGTAGGT3'
　　 PCR擴增3號外顯子，PCR擴增產(chǎn)物由北京華大基因完成測序，分析測序結(jié)果，找出三個cSNP位點，計算突變頻率。
　　 2.4、統(tǒng)計分析
　　 使用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)值以平均值±標準差（(x)±s）表示，三組間差

17、異比較采用方差分析，三組間兩兩比較采用Bonfferoni法。應用免費在線軟件檢查各個人群基因型分布是否符合哈迪溫伯格平衡(http://www.kursus.kvl.dk/shares/vetgen/_Popgen/genetik/applets/kitest.htm)，應用Logistic回歸檢驗各基因型以及不同組合對食管癌的患病風險的影響（OR值以及其95％可信區(qū)間）。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 3、結(jié)果

18、r>　　 3.1、血清核黃素水平測定
　　 3.1.1、三組年齡、性別構(gòu)成比較
　　 食管癌組病例445例，男、女所占比例分別為81.35％和18.65％;≥50歲和＜50歲的男性患者所占比例分別為57.75％和23.60％，≥50歲和＜50歲的女性患者所占比例分別為10.56％和8.09％。對照組人群689例，男女構(gòu)成比分別為76.92％和23.08％;≥50歲和＜50歲的男性患者所占比例分別為49.20％和27.7

19、2％，≥50歲和＜50歲的女性患者所占比例分別為16.40％和6.68％。林州移民組347例，男、女構(gòu)成比分別為77.81％和22.19％;≥50歲和＜50歲的男性患者所占比例分別為51.30％和26.51％，≥50歲和＜50歲的女性患者所占比例分別為9.51％和12.68％。三組人群在年齡、性別構(gòu)成上無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 3.1.2、三組核黃素水平比較
　　 食管癌組血清中核黃素水平顯著低于對照組(73

20、1.69±330.67ug/Lvs1090.43±445.08ug/L，P＜0.05)和林移組（731.69±330.67ug/Lvs897.58±177.78ug/L，P＜0.05）;而對照組血漿中核黃素水平(1090.43±445.08ug/L)高于林移組(897.58±177.78ug/L)(P＜0.05)。
　　 3.2、組織核黃素水平測定
　　 3.2.1、兩組年齡、性別構(gòu)成
　　 食管癌組:共250例

21、，男、女構(gòu)成比例分別為56.8％和43.2％;≥50歲和＜50歲患者比例分別為76.4％和23.6％;男性患者中，≥50歲和＜50歲的患者比例分別為42.4％和14.4％;女性患者中，≥50歲和＜50歲的患者比例分別為34.0％和9.2％。
　　 對照組:共289例，男、女構(gòu)成比分別為61.2％和38.8％;≥50歲和＜50歲的健康體檢者所占比例分別為69.6％和30.4％;在男性人群中，≥50歲和＜50歲人群所占比例分別為43

22、.6％和17.6％;在女性人群中，≥50歲和＜50歲人群所占比例分別為26.0％和12.8％。
　　 3.2.2、兩組核黃素水平比較
　　 食管癌組患者血漿中核黃素水平顯著低于對照組人群(753.46±624.56vs1097.63±808.12)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);食管癌組織中核黃素含量低于邊緣正常對照組織含量(17.45±3.43vs22.06±3.21)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。

23、　　 3.3、C20orf54基因中三個cSNP位點與食管癌遺傳易感性的研究
　　 3.3.1、兩組性別、年齡、吸煙人數(shù)、飲酒、家族史、血型及BMI構(gòu)成
　　 食管癌組和對照組在性別、年齡與吸煙人數(shù)構(gòu)成等方面無差異。飲酒者和有UGIC家族史者在ESCC中的比例（分別為:46.7％和27.5％）明顯高于對照組（分別為:37.2％和18.2％），因此飲酒和UGIC家族史可顯著增加人群ESCC的發(fā)病風險(P=0.045和P=

24、0.014)，經(jīng)性別、年齡狀況校正后的OR值分別為1.78(95％CI=1.12-2.83)和1.75(95％CI=1.10-2.79);不同血型的人群在食管癌組與對照組分布不同(P=0.021)，B血型人群ESCC的發(fā)病風險顯著低于A型血型人群，經(jīng)性別、年齡狀況校正后的OR值為0.52(95％CI=0.31-0.87);不同BMI指數(shù)的人群在食管癌組與對照組分布亦不同(P=0.000)，相對于BMI＞24的人群，BMI＜18.5和BM

25、I為18.5-24之間的人群顯著增加A型血型人群ESCC的發(fā)病風險，經(jīng)性別、年齡狀況校正后的OR值分別為4.52(95％CI=2.34-8.72)和2.70(95％CI=1.67-4.37)。
　　 3.3.2、C20orf54基因rs3746804、rs3746803、rs3746802位點多態(tài)性分析
　　 3.3.2.1、C20orf54基因rs3746804(1139C＞T)位點多態(tài)性分析
　　 C20or

26、f54基因rs3746804位點基因型的頻率在食管癌組和對照組中分布符合Handy-Weinberg平衡(x2=2.58，P=0.108)。在食管癌患者和對照組中C/C、C/T和T/T各基因型的頻率差異具有統(tǒng)計學顯著性(x2=8.06，P=0.018)。在調(diào)整了年齡、性別等因素后，攜帶C/T基因型的個體較C/C攜帶者罹患食管癌的風險顯著降低(校正OR=0.58，95％CI:0.38-0.88)。
　　 對吸煙、飲酒、家族史、血型

27、和體質(zhì)指數(shù)等因素分層后進行條件logistic回歸分析，結(jié)果顯示，ESCC組和對照組中吸煙者的基因型頻率分布有顯著差異。與C/C相比，C/T基因型不但可以顯著降低吸煙組ESCC的發(fā)病風險（經(jīng)性別和年齡校正后的OR=0.37，95％CI:0.20-0.68），而且顯著降低飲酒組ESCC的發(fā)病風險（經(jīng)性別和年齡校正后的OR=0.31，95％CI:0.15-0.64）。同時，ESCC組和對照組中無UGIC家族史的人群基因型頻率分布亦有顯著性差

28、異（經(jīng)性別和年齡校正后的OR=0.48，95％CI:0.30-0.78）。在BMI為18.5-24的組中，ESCC患者組和對照組基因型頻率分布有顯著性差異。與C/C相比，C/T基因型也可顯著降低吸煙組ESCC的發(fā)病風險(經(jīng)性別和年齡校正后的OR=0.56，95％CI:0.32-0.96)。
　　 3.3.2.2、C20orf54基因rs3746803(1172C＞T)位點多態(tài)性分析
　　 食管癌組和對照組中C/C、C/T

29、和T/T基因型的頻率分布差異具有統(tǒng)計學意義(x2=13.10，P=0.001)。在調(diào)整了年齡、性別等因素后，攜帶C/T基因型和T/T基因型的個體較C/C攜帶者罹患食管癌的風險顯著降低（校正OR=0.66，95％CI:0.41-1.05）。
　　 對吸煙、飲酒、家族史、血型和體質(zhì)指數(shù)等因素分層后進行條件logistic回歸分析，結(jié)果顯示在不吸煙組中，與C/C相比，C/T和T/T基因型顯著降低食管癌發(fā)生率（經(jīng)年齡和性別校正后OR=0

30、.47，95％CI:0.23-0.97），在無UGIC家族史的人群中，C/T和T/T基因型亦顯著降低食管癌發(fā)生風險(經(jīng)年齡和性別校正后的OR=0.57，95％CI:0.34-0.98)。然而，在有UGIC家族史的人群中，與C/C相比，C/T和T/T基因型增加食管癌發(fā)病風險，但差異無統(tǒng)計學意義，在O型血人群中，C/T和T/T基因型亦顯著增加食管癌發(fā)生的風險性(經(jīng)年齡和性別校正后OR=0.30和0.47，95％CI:0.22-0.99)。<

31、br>　　 3.3.2.3、C20orf54基因rs3746802(1246A＞G)位點多態(tài)性分析
　　 食管癌組和對照組中C/C、C/T和T/T各基因型的頻率差異具有統(tǒng)計學顯著性（x2=7.97，P=0.019）。在調(diào)整了年齡、性別等因素后，攜帶A/G基因型和G/G基因型的個體較A/A攜帶者罹患食管癌的風險顯著降低（校正OR=0.53，95％CI:0.34-0.84）。
　　 對吸煙、飲酒、家族史、血型和體質(zhì)指數(shù)等因

32、素分層后進行條件logistic回歸分析，結(jié)果顯在不吸煙組中，與A/A相比，A/G和G/G基因型顯著降級食管癌發(fā)生率（經(jīng)年齡和性別校正后OR=0.46，95％CI:0.23-0.92）。在喝酒人群中，與A/A相比，A/G和G/G基因型顯著降級食管癌發(fā)生率(經(jīng)年齡和性別校正后OR=0.39，95％CI:0.19-0.82)。在無UGIC家族史的人群中，與A/A相比，A/G和G/G基因型顯著降級食管癌發(fā)生率(經(jīng)年齡和性別校正后OR=0.55

33、，95％CI:0.33-0.92)。
　　 4、結(jié)論
　　 4.1、對照組血清核黃素水平高于林州組，而林州組高于食管組。表明，食管癌患者血漿中存在核黃素缺乏現(xiàn)象。
　　 4.2、食管癌組織中核黃素水平顯著低于對照組組織中核黃素水平(17.45±3.43vs22.06±3.21，P＜0.001)，提示核黃素缺乏與食管癌發(fā)生相關(guān)。
　　 4.3、C20orf54基因中三個錯義SNP位點rs3746804、rs