MN9202手性對映體對心肌細胞作用的差異性及其對內毒素致心肌損傷的保護作用與機制.pdf

1、目的：①建立MN9202 手性固定相HPLC 拆分方法，制備單一對映體，比較MN9202 對映體對心肌細胞收縮、舒張功能及鈣瞬變的影響，及其對離子通道的立體選擇性；②探討MN9202 對心肌的保護作用及其機制。為正確評價MN9202 消旋體及其對映體作用的差異性，為二氫吡啶類鈣通道拮抗劑的臨床應用提供科學依據。 方法：①采用Daicel OJ-H 手性固定相色譜柱，通過對流動相中正己烷與乙醇的比例、添加三乙胺的量對MN9202

2、 對映體的保留時間及分離度的影響進行考察，優(yōu)化色譜條件，拆分MN9202 消旋體。②采用IonOptix 單細胞動緣探測系統(tǒng)同步檢測MN9202 消旋體、S-(-)-MN9202 和R-(+)-MN9202 作用后心肌細胞收縮、舒張和鈣瞬變的變化。③采用全細胞膜片鉗方法，比較MN9202 消旋體、S-(-)-MN9202 和R-(+)-MN9202 對心肌細胞L 型鈣通道電流密度的影響。進而探討各藥物對L 型鈣通道穩(wěn)態(tài)激活動力學和穩(wěn)態(tài)失

3、活動力學特性的影響。④通過股靜脈注射LPS 建立感染性休克致動物心肌損傷模型，研究MN9202 對心肌的保護作用；RM-6200 型四道生理記錄儀實時監(jiān)測血壓等參數；用ELISA 法測定血漿TNF-α水平；取心肌組織樣本，進行HE 染色，比較心肌形態(tài)學改變。⑤原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞，用LPS 和不同濃度的MN9202 消旋體、對映體及氨氯地平作用，采用ELISA 法測定培養(yǎng)上清液中TNF-α含量，RT-PCR 及免疫熒光法分別測定心肌

4、細胞中TNF-αmRNA 和蛋白的表達。⑥ RT-PCR 和western blot 法分別測定LPS 刺激不同時間及DHPs 作用后心肌細胞iNOS、COX-2 mRNA 和蛋白的表達。Westernblot 法測定磷酸化Akt 和總Akt 的表達。 結果: ①本研究建立的MN9202 HPLC 手性拆分條件為：Daicel OJ-H 手性分析柱，正己烷-乙醇-三乙胺（93︰7︰0.5，V︰V︰V）為流動相，流速為0.5ml

5、/min，檢測波長為237 nm。用此法MN9202 對映異構體可達到基線分離，并可少量制備S-(-)-MN9202 和R-(+)-MN9202。②不同濃度的MN9202 消旋體和S-(-)-MN9202 可劑量依賴性抑制大鼠單個心肌細胞的收縮：在1×10-5mol/l 濃度時，百分峰值收縮幅度(PTA ％baseline)與對照組相比分別降低了73.8 ％和92.7 ％；而R-(+)-MN9202 則呈劑量依賴性增強心肌細胞的收縮，1

6、×10-5 mol/l 時， PTA ％baseline 升高了18.2 ％ 。MN9202 消旋體和S-(-)-MN9202 劑量依賴性抑制單個心肌細胞鈣瞬變幅度（△FFI）。與對照組相比，1×10-5 mol/l MN9202 消旋體和S-(-)-MN9202，細胞鈣瞬變分別由0.45±0.04 下降到0.07±0.02，及由0.45±0.04 下降到0.05±0.01（P<0.01）。而R-(+)-MN9202 則增加了鈣瞬變幅度

7、：在最大濃度1×10-5 mol/l 時，細胞鈣瞬變由0.45±0.01 升高到0.58±0.05（P<0.01）。③ MN9202 消旋體劑量依賴性的降低了L 型鈣通道電流密度。檢測電壓為0 mV，MN9202 濃度為0.03、0.1、0.3、1 和3 μmol/l 時，CaL 電流峰值的密度較對照組分別減少了6.7 ％、15.0 ％（P<0.01）、27.5 ％（P<0.01）、50.7 ％（P<0.01）和69.5 ％（P<0.0

8、1）；但藥物并未改變L 型鈣通道激活的閾電位（-40 mV）和峰值電流電位（0 mV）。S-(-)-MN9202 也抑制了L 型鈣通道電流密度，檢測電壓為0 mV 時，1 μmol/lS-(-)-MN9202 使CaL 電流峰值的密度從對照組的-9.8±1.0 減少到-3.2±0.9（減少了67 ％）（P<0.01）。而1 μmol/l R-(+)-MN9202 則引起了L 型鈣通道電流密度增加：檢測電壓為0 mV 時，使CaL 電流峰

9、值的密度從對照組的-9.3±0.7增加到-10.3±0.6（P<0.01）。MN9202 消旋體，S-(-)-MN9202 和R-(+)-MN9202均未明顯改變L 型鈣通道的激活特性。但各藥物均對通道穩(wěn)態(tài)失活有一定的影響： MN9202 消旋體和S-(-)-MN9202 均使穩(wěn)態(tài)失活曲線左移，而R-(+)-MN9202 使穩(wěn)態(tài)失活曲線輕微右移。④ LPS 在30 min 內引起大鼠平均動脈壓的快速下降，從119±4 降至85±2 mm

10、Hg（P<0.05）；60 min 后，大鼠平均動脈壓仍持續(xù)下降，在240 min 時為81±3 mmHg。10 及30 μg/kg MN9202消旋體給藥后，延緩了LPS 對大鼠平均動脈壓的下降。但MN9202 的應用并未改變LPS 對心率的影響。給予LPS 使血漿中TNF-α的水平發(fā)生了變化，先升高，至1 小時達到峰值，而后逐漸降低。MN9202 給藥后可使LPS 引起的大鼠血漿TNF-α升高的峰值顯著降低（P<0.05）。⑤正常心

11、肌細胞幾乎不表達TNF-α，但細胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量可隨LPS 濃度的增加而提高；TNF-α的釋放與mRNA 表達也隨著LPS 刺激時間的延長而顯著升高，在刺激后12 小時達高峰。0.1 ~ 10 μmol/l 的氨氯地平、MN9202 消旋體、R-(+)-MN9202 對映體可濃度依賴性的抑制LPS 刺激的TNF-α的釋放和mRNA 的表達，S-(-)-MN9202 對映體對TNF-α的釋放及mRNA 的表達無明顯影響。1.0

12、μmol/l 的氨氯地平、MN9202 消旋體、R-(+)-MN9202、S-(-)-MN9202對TNF-α釋放的抑制率分別為52.41、31.62、49.81 和2.25 ％。⑥ MN9202消旋體可濃度依賴性地抑制LPS 刺激所致iNOS 和COX-2 轉錄和翻譯水平的表達；1.0 μmol/l 的MN9202 消旋體對COX-2 的抑制作用與氨氯地平相當，對iNOS 的抑制作用強于氨氯地平；R-(+)-MN9202 明顯抑制iN

13、OS 和COX-2的表達（P<0.05），而S-(-)-MN9202 對iNOS 和COX-2 的表達均無影響。⑦LPS 刺激的同時，用MN9202 消旋體、R-(+)-MN9202 對映體或氨氯地平處理心肌細胞，均可明顯增加pAkt 的表達（P<0.05）；但S-(-)-MN9202 對Akt的活化無明顯影響。用PI3K 抑制劑wortmannin 或LY294002 預處理2 h 后，LPS 和DHPs（MN9202 消旋體、R-(

14、+)-MN9202 對映體和氨氯地平）共處理心肌細胞，各DHPs 處理組Akt 的活化均受到抑制；3 種DHPs 類化合物對TNF-α釋放的抑制作用均可被wortmannin 或LY294002 不同程度的降低；Cox-2 和iNOS 蛋白的表達與無PI3K 抑制劑預處理組相比無顯著性差異。 結論: ①本研究建立的手性固定相拆分條件為MN9202 單一對映異構體的分離、制備及含量測定等提供了簡單、快捷的方法。②兩種MN9202

15、 對映體對心肌細胞收縮與舒張?zhí)匦?、鈣瞬變和L 型鈣通道均具有立體選擇性。S-(-)-MN9202 表現(xiàn)出了拮抗特性，而R-(+)-MN9202 則具有一定的激動活性。③ MN9202 對LPS 致大鼠心肌損傷有保護作用，此作用與其抑制LPS 引起的TNF-α、iNOS 和COX-2 表達升高密切相關，其中R-(+)-MN9202 是抑制炎癥相關基因表達的優(yōu)映體。④ MN9202 通過激活PI3K，引起下游Akt 的活化，參與了TNF-α