金葡菌α-毒素對BALB-c小鼠成纖維細(xì)胞水通道蛋白1（AQP1）表達(dá)的影響.pdf

1、前言：水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是近年來發(fā)現(xiàn)存在于哺乳動物細(xì)胞膜上的特異轉(zhuǎn)運水的蛋白質(zhì)，肺組織有六種(AQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8、AQP9)，其中AQP1存在于支氣管周圍血管床和肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。有研究顯示：水通道在肺泡液體轉(zhuǎn)運中起著重要作用，其中AQP1是肺血管滲透性的決定性因素。金葡菌α-毒素(α-Toxin)是金葡菌的主要致病因子，它可引起細(xì)胞滲透壓的失衡，本研究的目的就是通過金葡菌α-

2、毒素對BALB/c小鼠成纖維細(xì)胞水通道蛋白1(AQP1)表達(dá)的影響，探討α-毒素的致病機(jī)理與AQP1的關(guān)系。 材料和方法：一、材料研究對象：BALB/c小鼠成纖維細(xì)胞株(BALB/c3T3)實驗試劑：MEM、胎牛血清、L-型谷氨酰胺、青鏈霉素、胰酶、金葡菌α-毒素、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白分析試劑盒、一抗、二抗、ECL-plus、PVDF膜。 二、方法1.加入α-Toxin：將小鼠成纖維細(xì)胞(BALB/c3T3)培養(yǎng)在M

3、EM中，放在37℃含有5％CO2的孵箱中孵育，90％細(xì)胞單層融合時傳代培養(yǎng)用于實驗。將上述細(xì)胞分為對照組及實驗組，實驗組加入α-Toxin30μg/ml刺激細(xì)胞4h、6h，于光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。然后收集細(xì)胞，加入裂解液吹打混勻，用紫外吸收法測定吸光值(OD值)，計算樣本的蛋白濃度。 2.AQP1蛋白的表達(dá)：應(yīng)用Western-blot方法檢測。 3.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析。 結(jié)果1.α

4、-Toxin對BALB/c3T3細(xì)胞形態(tài)的影響正常時，細(xì)胞主要呈梭形，多角狀，分裂相細(xì)胞呈類圓形，單層貼壁生長。加入α-Toxin后4h，細(xì)胞體積變大，胞漿淡染，細(xì)胞核濃染或碎裂。6h時細(xì)胞體積更大，核碎裂，細(xì)胞溶解死亡增多。 2.Western-blot檢測AQP1蛋白的表達(dá)可見約28KD位置的發(fā)光條帶。其表達(dá)隨時間增加明顯。統(tǒng)計學(xué)分析組間差異有顯著性。 討論：水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一組水選擇通

5、道的分子家族，目前研究發(fā)現(xiàn)，AQP1在組織中的分布與其介導(dǎo)的水的通透性有關(guān)，研究顯示：AQP1基因敲除的小鼠出現(xiàn)尿崩癥，離體實驗證明：缺乏AQP1，使近曲小管滲透水通透性降低，重吸收降低；產(chǎn)期大鼠肺AQP1、AQP4、AQP5mRNA表達(dá)增加；懷孕、充血性心力衰竭時肺AQP1、AQP2表達(dá)增加；腺病毒感染引起AQP1和AQP5低表達(dá)；脂多糖，腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β刺激鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞AQP1表達(dá)下降；AQP1缺乏鼠腫瘤生長

6、明顯受到抑制，病理可見腫瘤再生血管減少，壞死增加，體外實驗可見AQP1缺乏鼠的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞侵襲性明顯減弱，由此可推測：AQP1的表達(dá)異常和調(diào)節(jié)失控與某些水代謝疾病有關(guān)，現(xiàn)已成為人們研究的熱點。 本實驗應(yīng)用金葡菌α-毒素(α-Toxin)刺激BALB/c小鼠3T3細(xì)胞4h、6h后，顯微鏡下觀察可見細(xì)胞由梭形逐漸變圓，細(xì)胞體積變大，胞漿淡染，細(xì)胞壞死脫落，這與α-Toxin在細(xì)胞膜上的孔隙形成有關(guān)，本實驗加入α-Toxin檢測總蛋

7、白濃度發(fā)現(xiàn)，4h時測得的蛋白濃度校對照組增加，而6h時測得的蛋白濃度較4h時的降低，但接近對照組的蛋白濃度，這與毒素作用于細(xì)胞后，細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成減少乃至停止有關(guān)，但Western-blot顯示：α-Toxin與細(xì)胞作用時，隨著時間增加AQP1的表達(dá)增加，組間差異有顯著意義。表明α-Toxin作用于BALB/c3T3細(xì)胞后不僅沒有使AQP1的表達(dá)下降，反而卻是AQP1表達(dá)增加。由此我們推測：可能是α-毒素單體在作用細(xì)胞膜的過程中，孔隙形

8、成導(dǎo)致水的內(nèi)流增加，細(xì)胞為了減輕這種損害，刺激AQP1的表達(dá)增加，迫使水由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外流動；或者是直接或間接改變了AQP1數(shù)量和分布，使得細(xì)胞膜上的蛋白數(shù)量增加，而胞漿內(nèi)的蛋白數(shù)量減少，加速水由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外流動，減輕細(xì)胞的水腫和死亡。 結(jié)論1.金葡菌α-毒素作用于BALB/c小鼠成纖維細(xì)胞后，隨著時間增加細(xì)胞形態(tài)可發(fā)生明顯的變化，最后導(dǎo)致細(xì)胞的溶解死亡。 2.金葡菌α-毒素可誘導(dǎo)BALB/c小鼠成纖維細(xì)胞AQP1表達(dá)