MDM4S在急性髓系白血病中的表達及其在復雜核型形成中的作用.pdf

1、目的：
　　伴復雜核型急性髓系白血?。╝cutemyeloidleukemiawithcomplexkaryotype,CK-AML）大約占成人AML的10％～15%，并且隨著年齡的增長，發(fā)生率增加。復雜核型是AML獨立的預后不良因素，臨床化療緩解率低，預后差，缺乏有效的化療方案。研究復雜核型形成機制有望找到有效的治療靶點，改善患者預后。本研究通過核型分析篩選初發(fā)急性髓系白血病伴復雜核型患者，從P53抑制因子鼠雙微體基因4（mou

2、sedoubleminute4，MDM4）及其短剪接體(shortisoformofMDM4,MDM4-S)與復雜核型形成關系入手，檢測CK-AML與正常核型AML患者MDM4及MDM4-S的表達水平，并構建MDM4S慢病毒載體，感染表達野生型P53的HepG2細胞株，觀察細胞周期、細胞增殖、P53通路相關蛋白和紡錘體檢查點相關蛋白表達的變化，從而在細胞和分子水平探討復雜核型形成的可能機制。
　　方法：
　　1.采用G/R顯

3、帶核型分析篩選具有復雜核型的初發(fā)AML患者
　　總結患者特征和預后，對140例初發(fā)AML患者進行G/R顯帶核型分析，具有3種或3種以上的染色體異常者，即確定為伴有復雜核型的AML患者。
　　2.采用PCR、RT-PCR及實時定量RT-PCR檢測相關基因突變及MDM4FL、MDM4S的表達
　　提取140例初發(fā)AML患者骨髓樣本的DNA及總RNA，通過PCR、RT-PCR及實時定量RT-PCR方法檢測TP53、FLT3-

4、ITD、AML1基因突變、MDM2、MDM4及其剪接體MDM4-S的表達水平等，分析各種相關基因的突變及MDM4-S/MDM4-FL比值的變化。
　　3.構建MDM2、MDM4S慢病毒表達載體
　　設計含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點的引物，上游引物包含起始密碼子，下游引物包含終止密碼子，以K562細胞cDNA為模板，高保真酶擴增目的基因，通過與載體雙酶切，連結，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，挑克隆測序，將含有正確克隆的菌液搖菌提質(zhì)粒，-2

5、0℃保存?zhèn)溆?。將構建成功的各表達質(zhì)粒pCDH1-MDM2、pCDH1-MDM4S分別與包裝輔助質(zhì)粒pPACKH1-GAG，pPACKH1-REV和pVSV-G磷酸鈣共沉淀法共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝病毒顆粒，進行滴度測定。包裝好的病毒感染HepG2細胞株，并篩選陽性細胞株，擴大培養(yǎng)。
　　4.細胞周期、細胞增殖活性以及P53、P21、BubR1、SecurinmRNA和蛋白水平表達檢測
　　穩(wěn)定感染MDM2、MDM4S的Hep

6、G2細胞，在中期阻滯劑Nocodazole處理18小時后，收集細胞，固定，PI染色，流式細胞儀觀察細胞周期；采用MTT法檢測細胞增殖情況；RT-PCR及Western-blot檢測P53、P21、BubR1和Securin基因mRNA和蛋白水平表達變化。
　　結果：
　　1.在140例初發(fā)AML患者中篩選出15例復雜核型患者
　　1.115例復雜核型患者的一般特征及預后
　　15例復雜核型患者中，男女比例為8:7

7、；年齡≥60歲7例，占46.7%；白細胞數(shù)＞100×109/L者2例，占13.3%；FAB分型：M01例，M24例，M45例，M55例；核型中，-5：2例，-7：4例，-17：2例，+21：9例；治療效果，3例經(jīng)過1次化療達到CR，1例經(jīng)過2次化療達到CR，部分緩解2例，放棄治療2例。轉(zhuǎn)歸：目前死亡13例，存活時間中位數(shù)為292天（66-738天）。
　　1.215例CK-AML患者核型分別為：
　　(1)49,XY,+13

8、,+19,+21
　　(2)52,XXX,+10,+13,+16,+21,+22
　　(3)54,XXX,+8,+11,+15,+16,-17,+19,+20,+21,+22
　　(4)47,XXY,+1,-2,-5,+12,-17,+19,+21,-22
　　(5)56,XXXY,+1,-2,+10,+11,+12,+15,+20,+21,+21,+22
　　(6)49,Y,+1,+5,-7,+8,+13

9、,+21
　　(7)50,XX,+16,+19,+20,+21
　　(8)51,XX,-7,+13,+15,+21,+21,+21,+22
　　(9)92,XXXX
　　(10)49,XY,+6,add(7)(p22),+8,add(11)(q25),+15
　　(11)49,Y,+1,+5,-7,+8,-11,+13,+22,+t(11;17)(q23;q21)
　　(12)51,XY,-7,+13

10、,+15,+16,+19,+22,+22
　　(13)48,XXY,+1,-2,-5,+12,+18
　　(14)50,XX,+1,-7,+8,+13,+15,+19
　　(15)51,XXX,+10,+13,+15,+16
　　2.初發(fā)急性髓系白血病相關基因突變及MDM4-S/MDM4-FL表達分析
　　2.1基因突變檢測結果
　　15例CK-AML患者TP53基因在DNA及RNA水平均未檢測出突變

11、，但通過FISH檢測有兩例TP53丟失一個拷貝；AML1基因各個外顯子未檢出突變；FLT3-ITD突變率在CK-AML為20%，正常核型AML為23.2%，二者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　2.2相關基因表達量檢測結果
　　半定量RT-PCR檢測復雜核型組與正常核型組的兩種剪接體MDM4-S、MDM4-FL相對表達量，結果發(fā)現(xiàn)復雜核型組MDM4S/MDM4FL比值和MDM4-S/MDM4-total比值均高于正常核

12、型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　實時定量RT-PCR檢測MDM2、MDM4FL和MDM4S表達量，經(jīng)統(tǒng)計學分析，復雜核型組與正常核型組相比，MDM2表達水平無差異（P＞0.05），復雜核型組MDM4-FL和MDM4-S相對表達量高于正常核型組，差異具有統(tǒng)計學意義。（P＜0.05）
　　3．MDM2、MDM4-S基因慢病毒表達載體的構建與感染
　　通過測序鑒定，MDM2、MDM4-S序列與GeneBank

13、中序列一致，讀碼框未發(fā)生移位。包裝病毒并進行滴度測定。包裝好的病毒感染HepG2細胞株，并篩選陽性細胞株，擴大培養(yǎng)。本實驗中陽性率達到了60%～80%，得到純度較高的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了目的基因的細胞。
　　4.細胞周期及細胞增殖實驗
　　4.1細胞周期檢測
　　Nocodazole處理18h后，空白質(zhì)粒組細胞停留在4N，即M期百分比為51.94%，其余兩組4N的百分比分別為：MDM2:33.35%;MDM4S:37.32%。與

14、空白對照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDM2和MDM4S的兩組細胞4N細胞比值減少，即M期所占比例減少，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4.2Nocodazole處理不同時間點G0/G1期細胞所占的比例
　　在Nocodazole處理0h，G0/G1期細胞所占的比例大約在40%～60%，到8h，三組細胞G0/G1期細胞所占的比例明顯下降，隨著作用時間的延長，三組細胞G0/G1期細胞所占的比例逐漸上升，在Nocodazole處理18

15、h時穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDM2和MDM4S的兩組細胞與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明中期阻滯在MDM4S組降低。
　　4.3細胞增殖實驗
　　MTT檢測空白質(zhì)粒組、MDM2和MDM4S細胞活性，與空白對照組比較，穩(wěn)定表達MDM2與MDM4S細胞增殖活性升高，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　5.Real-timeRT-PCR
　　5.1穩(wěn)定表達MDM2、MDM4S組TP53mRNA相對表達量與空

16、白質(zhì)粒組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　5.2Nocodazole處理組與對照組相比，穩(wěn)定表達MDM2、MDM4S組BubR1mRNA表達水平下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；穩(wěn)定表達MDM4S組SecurinmRNA表達水平下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Nocodazole處理空白質(zhì)粒組，SecurinmRNA表達升高，與DMSO處理組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　6.wes

17、tern-blot檢測
　　6.1P53、P21表達水平
　　穩(wěn)定表達MDM2細胞P53、P21表達水平下降，與對照組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。穩(wěn)定表達MDM4S細胞P21蛋白表達水平降低，與對照組相比具有統(tǒng)計學意義；P53蛋白表達水平與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　6.2BubR1、Securin表達水平
　　Nocodazole處理后18h后，穩(wěn)定表達MDM2和MDM4S細胞中

18、BubR1蛋白和Securin蛋白表達水平下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?？瞻踪|(zhì)粒組在Nocodazole處理后，Securin蛋白表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：
　　1.復雜核型組MDM4-S相對表達量高于正常核型組。
　　2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDM2、MDM4-S細胞株紡錘體檢查點功能減弱。
　　3.提高細胞內(nèi)MDM4S/MDM4FL比值，可抑制P53通路活性。
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