Pdx1、Ngn3和MafA共轉染大鼠肝細胞轉分化成為胰島素分泌細胞的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的
　　糖尿病已經成為嚴重威脅人類健康的最主要疾病之一，全球糖尿病患者已超過2億人，并將于2025年達到4億人。目前治療1型糖尿病主要依賴于注射胰島素，這卻并不能阻止慢性血管病變的發(fā)展，且有發(fā)生低血糖等并發(fā)癥的危險。2000年埃德蒙頓方案實施以來，胰島移植被認為是治療1型及部分重癥2型糖尿病的理想方法。但是，胰島移植臨床應用也受到許多因素限制，其中最主要障礙是人供胰嚴重短缺。尋找可替代胰島β細胞并且能夠提供胰島素分泌功

2、能的移植供體，是當前研究的熱點。
　　而細胞核重編程技術的出現，為尋找替代胰島β細胞的研究提供新的希望。細胞核重編程指的是細胞內的基因表達由一種類型變成另一種類型。通過這一技術，可以在同一個體上將較容易獲得的細胞類型轉變成另一種較難獲得的細胞類型。在這個領域的一個新的進展就是將胰腺的外分泌細胞直接轉變成內分泌細胞。在這個研究當中，用腺病毒轉入三個通常為胰島β細胞分化所需的轉錄因子胰腺-十二指腸同源框1(pancreaticduod

3、enalhomeobox1，Pdx1)、神經元素3（neurogenin3，Ngn3）和肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物A(v-mafmusculoaponeuroticfibrosarcomaoncogenehomologueA，MafA)后，就成功轉染的胰腺外分泌細胞轉變成能產生胰島素的細胞。Slack等構建了一個腺病毒載體Ad-PNM，同時包含小鼠Pdx1、Ngn3和MafA基因的編碼序列在同一的轉錄單元，這樣既可以保證實驗細胞同時接受

4、上述的三個基因，同時也可以簡化操作步驟。應用此載體，Slack等人成功的將大鼠胰腺外分泌細胞系AR42j-B13轉化為胰島素分泌細胞。
　　在個體發(fā)育過程中，肝臟和胰腺都起源于前腸末端，發(fā)育上的同源性提示肝臟和胰腺在細胞增殖和分化調控等方面有很高的相似性，這就為肝臟來源的細胞轉分化為胰島β細胞提供可能性。目前已有證據表明，有些胰腺發(fā)育相關的轉錄因子可將肝原始細胞、成熟的肝細胞，甚至肝腫瘤細胞誘導分化為可分泌胰島素的胰島細胞樣細胞。

5、考慮到肝細胞的易獲得性，肝細胞轉化胰島素分泌細胞的研究將會為臨床應用帶來更好的前景。
　　同時肝細胞是人體重要的一類細胞，主要能夠合成白蛋白等血漿蛋白、參與膽汁合成、脂類代謝、糖代謝以及蛋白加工等。另外，肝特異性的轉錄因子還參與到胰島素合成和分泌過程。因而，研究在轉分化的胰島素分泌細胞內這些肝特異性基因和肝特異性轉錄因子是如何變化，既可進一步明確轉分化的詳細機制，又可以明確與胰島素合成和分泌相關的基因的改變情況，為進一步完善改造胰

6、島素分泌細胞提供實驗依據
　　方法
　　(1)采用脂質體轉染法將包含有Pdx1、Ngn3和MafA編碼區(qū)域的Ad-PNM質粒轉染大鼠肝細胞BRL3A，并低糖培養(yǎng)基中使其轉分化成為胰島素分泌細胞。以Ad-GFP轉染的細胞作為對照。倒置顯微鏡觀察轉染前，轉染后細胞第1、3、5和7天形態(tài)變化;采用生長曲線法觀察增殖能力變化情況。采用流式細胞術鑒定轉染效率。RT-PCR法檢測轉染后胰島素分泌細胞內外源性小鼠Pdx1、Ngn3和Maf

7、A，大鼠Pdx1、Ngn3和MafA，大鼠Ins1和Ins2基因的表達。采用Real-TimePCR法定量檢測轉染前及轉染后第1、3、5和7天的細胞內Insulin的相對表達量。采用免疫熒光檢測轉染后第1、3、5和7天的細胞內Pdx1、Ngn3、MafA和insulin蛋白的定位。采用Elisa法檢測轉染前及轉染后第1、3、5和7天的細胞內的胰島素含量以及分泌量。(2)采用免疫熒光檢測轉染后胰島素分泌細胞內albumin和insulin

8、蛋白的定位。分別采用Real-TimePCR和WesternBlot定量檢測轉染后胰島素分泌細胞內肝特異性基因(Alb、Glul和Factor(Ⅹ))和肝特異性轉錄因子（HNF1α、HNF3α、HNF6、LRH-1和C/EBP-β）的表達改變情況。
　　結果
　　(1)轉染包含有Pdx1、Ngn3和MafA編碼區(qū)域的Ad-PNM質粒后轉染后6hr即可觀察到細胞由正常狀態(tài)下的橢圓形變成扁平的類似于成纖維細胞的形狀。整細胞體積變

9、小，細胞漿變少，細胞核變小且不清晰。1d后這種轉變有所改善，部分細胞體積較6hr時明顯增大，細胞核清晰。而到3d時，大部分細胞重新變回或接近橢圓形，僅有少部分細胞仍為類似于成纖維細胞的形態(tài)。轉染后胰島素分泌細胞增殖能力明顯低于未轉染的細胞(P＜0.05)。流式細胞術顯示轉染后24hr有95.13±1.05％細胞的表達Pdx1蛋白熒光信號，說明轉染效率良好。轉染后24hr即可檢測到外源性小鼠來源Pdx1，Ngn3和MafA基因的mRNA水

10、平表達，而內源性大鼠Pdx1基因的mRNA始終沒有檢測到。在轉染后3d，可以檢測到大鼠胰島素基因Ins1和Ins2的mRNA表達。在轉染后第3天，可以觀測到胰島素分泌細胞內的insulin在mRNA水平表達。Elisa法轉染前細胞內幾乎檢測不到胰島素，而轉染后細胞內可以檢測到胰島素，并在轉染后第5天達到最高值，與細胞內總蛋白相比為81.97±3.10pg/μg。轉染前細胞沒有胰島素分泌能力，無論是在高糖或是低糖條件下。而轉染后細胞可以檢

11、測到分泌到培養(yǎng)液中胰島素，但在不同葡萄糖濃度條件下檢測到的胰島素含量沒有統(tǒng)計學差異，說明轉染后得到的胰島素分泌細胞并沒有根據葡萄糖濃度調節(jié)胰島素分泌的功能。(2)部分轉染后胰島素分泌細胞可于胞漿中檢測出Insulin的表達，而相對應的這些細胞內Albumin的表達出現下調或者消失。轉染后第5天Alb、Glul和FactorⅩ基因在mRNA和蛋白水平的表達對比未轉染前的表達水平有不同程度的下降(P＜0.05)。與肝臟特異性基因表達均下調不

12、同，肝臟特異性轉錄因子HNF1α、HNF3α和HNF6在轉染后出現表達上調(P＜0.05)，而轉錄因子Lrh1和C/EBP-β的表達水平明顯下調(P＜0.05)。
　　結論
　　(1)Pdx1、Ngn3和MafA成功的將大鼠肝細胞轉分化為胰島素分泌細胞。(2)轉分化后的胰島素分泌細胞能分泌一定量的胰島素，但并不能夠根據葡萄糖濃度進行而調節(jié)胰島素分泌量。(3)轉分化的胰島素分泌細胞內肝特異性基因和轉錄因子存在明顯改變，其中Al