豬miRNa-423-5p靶向SRF基因調(diào)控肌肉發(fā)育的初步研究.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類長度在21個(gè)核苷酸左右，進(jìn)化上保守的RNA分子。它通過實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，進(jìn)而參與各項(xiàng)生命活動(dòng)。豬肌肉發(fā)育受到眾多基因的調(diào)控，近年發(fā)現(xiàn)microRNA在骨骼肌的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著極為重要的作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-423-5p(miRNA-423-5p)在豬骨骼肌不同發(fā)育過程中呈現(xiàn)出顯著的差異表達(dá)，提示miR-423-5p可能通過靶向某些特定基因參與骨骼肌的生長發(fā)育調(diào)控。但至今未發(fā)現(xiàn)miR

2、-423-5p參與豬骨骼肌生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制的有關(guān)報(bào)道。因此本研究以miR-423-5p為主要研究對(duì)象，篩選其靶基因，并探討它們?cè)谪i骨骼肌生長發(fā)育過程中所發(fā)揮的作用。主要研究結(jié)果如下:
　　1.運(yùn)用TargetScan等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到SRF基因是豬miR-423-5p的一個(gè)潛在靶基因。
　　2.采用qRT-PCR的方法檢測(cè)了廣西巴馬小型豬miR-423-5p與SRF基因在5個(gè)不同日齡背最長肌中的表達(dá)情況，同時(shí)繪制了miR

3、-423-5p的組織表達(dá)譜。結(jié)果顯示:廣西巴馬小型豬背最長肌中miR-423-5pmRNA的表達(dá)水平隨著日齡的增長而不斷升高，SRF mRNA的表達(dá)水平則呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)，兩者呈負(fù)相關(guān)。在不同組織中，miR-423-5p均有表達(dá)，其中在心臟中表達(dá)量最高，在背最長肌、腦和腎中表達(dá)量也相對(duì)較高，在肝和脾中表達(dá)量相對(duì)較低。
　　3.利用克隆技術(shù)將miR-423-5p的前體序列連接到pLV-CMV-3xflag-EF1-GFP(pLV)

4、慢病毒載體上成功構(gòu)建了pLV-miR-423-5p重組載體，同時(shí)轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示過表達(dá)成功。
　　4.針對(duì)SRF基因設(shè)計(jì)引物，通過克隆技術(shù)將含有結(jié)合位點(diǎn)的SRF3'UTR片段以及結(jié)合位點(diǎn)缺失的SRF3'UTR片段插入到Psi-checkTM-2 vector中構(gòu)建靶標(biāo)正常載體SRF-WT和靶標(biāo)突變載體SRF-MUT，然后轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞系。利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析其熒光素酶活性，結(jié)果顯示:W

5、T組的熒光值極顯著低于MUT組和NC組，miWT組的熒光值極顯著低于miMUT、miNC和inWT組(P＜0.01)，MUT組與NC組間差異不顯著，miMUT、miNC和inWT組之間差異也不顯著(P＞0.05)。這一結(jié)果表明，miR-423-5p能與SRF基因相互作用，抑制其表達(dá)，SRF基因?yàn)閙iR-423-5p的一個(gè)靶基因。
　　5.誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化，收集細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示:隨著C2C12細(xì)胞的分化，m

6、iR-423-5p mRNA表達(dá)量呈明顯的上升趨勢(shì)，分化到第5天時(shí)有下降趨勢(shì);SRF mRNA表達(dá)量隨著C2C12細(xì)胞的分化呈明顯的下降趨勢(shì)，分化到第5天時(shí)有上升趨勢(shì)，兩者表達(dá)趨勢(shì)剛好相反，呈負(fù)相關(guān)性表達(dá)。在C2C12細(xì)胞分化過程中，MyoG mRNA表達(dá)量呈明顯的上調(diào)趨勢(shì);MyoD則在分化第0天和1天時(shí)表達(dá)量最高，到第3天時(shí)急劇下降而后慢慢上調(diào)。
　　6.C2C12細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-423-5p mimic/inhibitor后更

7、換分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-423-5p mimic的細(xì)胞，成功過表達(dá)miR-423-5p;轉(zhuǎn)染miR-423-5p inhibitor細(xì)胞的miR-423-5p表達(dá)受到抑制。當(dāng)過表達(dá)miR-423-5p時(shí)，SRF mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比下降，但差異不顯著(P＞0.05);MyoD和MyoG mRNA表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)。相反，當(dāng)miR-423-5p表達(dá)受到抑制時(shí)，SRF

8、 mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，但差異不顯著(P＞0.05); MyoD和MyoG mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05)。ELISA結(jié)果表明當(dāng)過表達(dá)miR-423-5p時(shí)，SRF蛋白濃度與對(duì)照組比顯著下降(P＜0.05)，而miR-423-5p表達(dá)受抑制時(shí)，SRF蛋白濃度與對(duì)照組比顯著上升(P＜0.05)。這些結(jié)果進(jìn)一步表明SRF是miR-423-5p的靶標(biāo)基因，且miR-423-5p主要在翻譯水平下調(diào)SRF的表達(dá)。
　　綜上所述，