豬蛔蟲與人蛔蟲成蟲及豬蛔蟲不同發(fā)育期miRNA表達譜比較及三個miRNA功能初步研究.pdf

1、豬蛔蟲（Ascaris suum）是一種寄生線蟲，在分類上隸屬線蟲綱（Nematoda）、蛔目（Ascaridata）、蛔科（Ascaridae）、蛔屬(Ascaris)，在全球廣泛流行，豬群感染率高達50％～70％。成蟲寄生于豬小腸腸腔內，在豬體內寄生的數(shù)量巨大，可達1000條以上，常引起腸腔堵塞，擾亂機體的消化吸收，導致消瘦、出血及生長不良。據(jù)估計雌性成蟲每天的產(chǎn)卵量可多達20萬到200萬個。豬蛔蟲幼蟲在豬體內移行會損傷肺臟和肝臟，

2、并引起其他繼發(fā)性疾病，導致幼齡豬死亡，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。另外豬蛔蟲在很長時間內被認為和人蛔蟲是一個種，豬蛔蟲幼蟲還會在人體寄生，引起眼幼蟲移行癥等。所以，對豬蛔蟲病的研究也具有重要公共衛(wèi)生學意義。
　　MicroRNA(miRNA)是一類內源性的非編碼小RNA，長度通常約18～22nt，廣泛存在于真核生物中，具有發(fā)育階段特異性、時序性或者組織特異性的表達特點，在轉錄后水平調節(jié)個體生長發(fā)育相關基因的表達。研究表明，寄生線蟲可以通

3、過miRNA實現(xiàn)對宿主和自身基因表達的精確調控，提高感染和增殖的能力，逃避免疫監(jiān)視。對這種機制的充分了解和把握有助于更好地理解寄生線蟲的調控機理和性別分化機制，從而很可能成為免疫預防或化學治療的“關鍵”靶分子。為此，本文分別對豬蛔蟲和人蛔蟲成蟲期miRNA進行深度測序，并對兩者的表達譜比較分析;同樣，對豬蛔蟲不同發(fā)育期miRNA進行深度測序，對表達譜進行分析比較;最后，選取三個miRNA(miRNA-36、miRNA-100b、miRN

4、A-81a)為研究對象，進一步研究其生物學功能。結果如下:
　　一、豬蛔蟲與人蛔蟲成蟲期miRNA表達譜及比較分析
　　采用深度測序獲得豬蛔蟲人蛔蟲成蟲miRNA表達譜數(shù)據(jù)，我們從人蛔蟲豬蛔蟲成蟲樣品中分別獲得了171及494 miRNA候選者。其中74個miRNA是兩種蛔蟲共有的，97和420個miRNA是人蛔蟲豬蛔蟲特異的。靶基因及功能注釋分析顯示兩類蛔蟲的很多靶基因與卵巢信息蛋白，卵黃蛋白原和軟骨素蛋白多糖有關。富集分

5、析顯示兩種蛔蟲的大多數(shù)miRNA靶基因是相似的，但是兩種蛔蟲靶基因數(shù)目不同，而某些功能如NADH脫氫酶及電子轉運功能等是豬蛔蟲特有的。豬蛔蟲人蛔蟲miRNA表達譜比較研究結果為豬蛔蟲人蛔蟲是一個種提供了一種證據(jù)。
　　二、豬蛔蟲不同發(fā)育階段miRNA高通量測序及生物信息學分析
　　建立了豬蛔蟲7個不同發(fā)育（包含蟲卵，肝階段L3期幼蟲，肺階段L3期幼蟲，L4期幼蟲，L5階段幼蟲，成熟雌性成蟲，成熟雄性成蟲）時期的文庫。高通量測

6、序后共獲得8516852條unique reads。在7個階段分別共獲得565、215、157、128、174、486和498個miRNA，其中通過同源性分析分別有75、95、82、77、79、80和85個miRNA是已知的，其余都是新miRNA。通過比對分析獲得75個miRNA在7個發(fā)育階段共同表達，437個miRNA在胚胎期特異表達，還有一些在胚胎期表達量非常高，如asu-miR-44b和asu-miR-5350a，暗示它們可能與胚

7、胎發(fā)育有關。165個miRNA是發(fā)育期特異表達的，asu-miR-184、asu-miR-5348、asu-miR-5351、asu-miR-5352、asu-miR-5367和asu-miR-72在L3期表達量特別高，可能與三期幼蟲的感染性有關。還有一些miRNA在兩個相鄰階段表達非常高，推測與發(fā)育期過渡有關，如asu-miR-239、asu-miR-279c、asu-miR-5357、asu-miR-5364和prd-let-7可能

8、與幼蟲到成蟲期過渡有關。RNAhybrid預測共得到1291個靶基因，GO分析發(fā)現(xiàn)很多靶基因在豬蛔蟲生長發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用，如與線蟲發(fā)育及壽命有關的，胚胎發(fā)育，蛻皮，發(fā)育期過度，生殖，產(chǎn)卵，遷移，形態(tài)改變等，富集分析顯示預測靶基因主要集中在催化及結合功能，其次是生物進程，細胞進程，代謝進程，發(fā)育進程。選擇3個卵階段特異表達的miRNA及5個所有發(fā)育階段共表達的miRNA進行了熒光定量分析，結果顯示5個階段共表達miRNA的定量結果與

9、預測均相符，卵時期特異表達的3個miRNA與測序結果不符。
　　三、豬蛔蟲三個miRNA的功能特征初步研究
　　設計合成了3個miRNA(miRNA-36，miRNA-100a，miRNA-81a)的mimic、inhibitor及相應的陰性對照，通過浸泡的方式導入蛔蟲幼蟲體內，用熒光定量來檢測miRNA及其靶基因的豐度變化。每個miRNA的功能用豬蛔蟲幼蟲的感染率及其從小鼠肝、肺回收的豬蛔蟲蟲體長度和寬度來評價。miRNA

10、 mimic浸泡進入后的蟲體的相應miRNA的表達水平上升，抑制劑處理蟲體的相應miRNA的水平下降，表明通過浸泡可以成功導入miRNA的mimic及inhibitor。miRNA mimic的導入在體內不發(fā)揮明顯的功能效果，蟲體的感染力生長發(fā)育沒有明顯變化，表明內源miRNA的表達水平可以維持蟲體的正常的發(fā)育。miRNA-36 inhibitor處理組每只小鼠的幼蟲感染量為71.40±25.22個，明顯低于inhibitor陰性對照（

11、170.89±12.45個）及空白組(230.30±17.47個)，差異顯著(P＜0.05);inhibitor處理組的蟲體長度為410.57±71.31μm，寬度為16.20±2.43μm，明顯低于陰性對照組及空白組(P＜0.01)。miRNA-100a inhibitor處理組每只小鼠的平均感染量為42.40±25.22個，與陰性對照（140.89±12.45μm）及空白（178.30±17.47μm）相比差異顯著;inhibito