不同來源空腸彎曲菌在4℃饑餓條件下能否進(jìn)入活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)及其形態(tài)隨時(shí)間的改變.pdf

1、目的:
　　1.本實(shí)驗(yàn)室保存的不同來源空腸彎曲菌在4℃饑餓條件下在35天的觀察期內(nèi)能否進(jìn)入活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)。
　　2.觀察本實(shí)驗(yàn)室保存的不同來源空腸彎曲菌在4℃饑餓條件下在35天的觀察期內(nèi)其革蘭染色形態(tài)隨時(shí)間的變化。
　　方法:
　　1.空腸彎曲菌菌株的復(fù)蘇和傳代:取自神經(jīng)病學(xué)實(shí)驗(yàn)室（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院）-80℃冰箱中保存的格林-巴利綜合征患者分離培養(yǎng)出的空腸彎曲菌菌株LC株，lulei株，由雞糞便中分離培養(yǎng)

2、出的chicken株和非GBS源的NCTC11168株，待凍存的菌株自然消融后，接種于哥倫比亞血平板（含7％無菌脫纖維羊血）上，放置于42℃微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)條件的三氣培養(yǎng)箱中，所有菌株培養(yǎng)24小時(shí)對(duì)應(yīng)的P1代菌株回收，取P1代菌落三區(qū)劃線接種于含7％無菌脫纖維羊血的哥倫比亞血平板上，放置于三氣培養(yǎng)箱，42℃微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)條件下，培養(yǎng)24小時(shí)獲得各菌株相應(yīng)的P2代菌株，取P2代菌落

3、三區(qū)劃線接種法接種于含7％無菌脫纖維羊血的哥倫比亞血平板培養(yǎng)基上，置于三氣培養(yǎng)箱，42℃微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)條件下，培養(yǎng)24小時(shí)得到各菌株相應(yīng)的P3代菌株。
　　2.鑒定空腸彎曲菌:革蘭染色法顯示菌株為革蘭陰性桿狀菌，馬尿酸水解試驗(yàn)結(jié)果顯示為陽(yáng)性。
　　3.收菌用無菌接種環(huán)分別刮取4株空腸彎曲菌少量P3代細(xì)菌于盛有3ml PBS（PH為7.2+-0.1）液的無菌西林瓶?jī)?nèi)，振蕩器振蕩充分搖勻制成菌懸液，

4、每株菌株做4個(gè)備份菌懸液并做好記號(hào)，所有的菌懸液濃度用細(xì)菌濁度儀定量在3*108 cfu/ml。
　　4.饑餓狀態(tài):將上述盛有菌懸液的無菌西林瓶置于4℃冰箱內(nèi)，不需要振蕩。
　　5.分別在菌懸液置于冰箱內(nèi)的第0天，第5天，第10天......用CTC-DAPI雙染法計(jì)數(shù)總的細(xì)菌數(shù)，活細(xì)菌數(shù)，平板直接計(jì)數(shù)法(HPC)計(jì)數(shù)可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)。分別對(duì)每株空腸彎曲菌的一個(gè)備份同時(shí)計(jì)數(shù)總細(xì)菌數(shù)，活細(xì)菌數(shù)及可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)。
　　6.平板直

5、接計(jì)數(shù)法用無菌雙蒸水連續(xù)稀釋的菌懸液樣本(0.1ml)一式三份接種到含7％無菌脫纖維羊血的哥倫比亞血平板培養(yǎng)基上。微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)42℃條件下孵育48h，計(jì)數(shù)在適當(dāng)?shù)南♂尪认碌腃FUs，并可以計(jì)數(shù)原來起初的樣本中的CFUs。當(dāng)可培養(yǎng)細(xì)胞少于300/ml時(shí)，0.1ml水樣本涂布在10個(gè)含5％馬血的哥倫比亞血平板培養(yǎng)皿上。
　　7.CTC-DAPI雙染法在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，取出來自空腸彎曲菌懸浮液中的樣本并根據(jù)

6、Cappelier et al.(1997)技術(shù)用CTC和DAPI染色細(xì)胞。為了激發(fā)細(xì)胞呼吸，0.5ml腦心浸液和100μl的0.05g/mL丙酮酸溶液加入到要進(jìn)行分析的0.5ml菌懸液中。CTC用雙蒸水稀釋到最終濃度即5mmo l/L，然后混合液在微需氧42℃下孵育4h。接著細(xì)胞會(huì)經(jīng)多聚黑碳膜過濾（0.2μm/孔，直徑25mm），并用5μg/mL DAPI液覆蓋5min，目的是復(fù)染。最后，染色劑會(huì)被真空抽濾，在蓋玻片蓋上前會(huì)滴上非熒光

7、的油。405nm的激發(fā)濾光片和455nm二色鏡的Olympus BX53熒光顯微鏡來觀察，這樣可以同時(shí)看到這兩種染色。隨機(jī)計(jì)數(shù)每個(gè)濾片的20個(gè)顯微視野。每個(gè)樣本，計(jì)數(shù)4個(gè)濾片。呼吸的細(xì)胞計(jì)數(shù)RCCs顯示CTC甲臘晶體，總細(xì)胞計(jì)數(shù)TCCs是用DAPI染色的。結(jié)果可以換成相應(yīng)的原始樣本中每mL細(xì)菌數(shù)，并可以計(jì)算出RCCs和TCCs的比例。實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。
　　8.根據(jù)菌株的狀態(tài)計(jì)數(shù)（細(xì)菌總數(shù)，和培養(yǎng)的菌數(shù)的活菌數(shù)）繪制隨時(shí)間變化的曲

8、線，當(dāng)平板計(jì)數(shù)(HPC)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)不為零時(shí)，細(xì)菌便進(jìn)入了VBNC狀態(tài)。
　　9.相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，取平板計(jì)數(shù)法后平板上生長(zhǎng)的單菌落，進(jìn)行革蘭染色。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，于干凈的載玻片上滴一小滴生理鹽水，用接種環(huán)挑取單菌落于生理鹽水中涂布均勻;自然干燥室溫;在酒精燈火焰幻燈片固定3～4次，每次1～2S;將載玻片置于支架上，順次使用結(jié)晶紫1min，自來水沖刷，盧戈氏碘液1min，自來水沖洗，95％酒精脫色0.5min，自來水沖洗，稀釋復(fù)紅1mi

9、n，自來水沖洗（每次自來水充分沖洗）。于室溫自然干燥后用1000倍油鏡觀察。
　　結(jié)果:
　　1.檢測(cè)的4株空腸彎曲菌菌株在35天觀察期均進(jìn)入了活的但非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)。
　　2.空腸彎曲菌lulei菌株的VBNC狀態(tài)在饑餓20天后進(jìn)入了活的但非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)。
　　3.空腸彎曲菌11168，lc，chicken菌株VBNC狀態(tài)在25天后進(jìn)入了活的但非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)。
　　4.被觀察的

10、4株空腸彎曲菌顯示出了空腸彎曲菌在4℃PBS液中出現(xiàn)不同形態(tài)改變?？漳c彎曲菌11168，chicken，LC菌株在25天的觀察期其形態(tài)經(jīng)歷了桿狀與球狀相互轉(zhuǎn)化，空腸彎曲菌11168菌株在第0天革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌，到第11天可見到大部分革蘭染色呈現(xiàn)出紅色球菌，第21天開始革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌?？漳c彎曲菌Lc菌株在第0天革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌，在第10天開始革蘭染色呈現(xiàn)出紅色球狀，第14天革蘭染色呈現(xiàn)出紅色短桿狀菌，第20天革蘭染色呈

11、現(xiàn)出紅色桿菌?？漳c彎曲菌chicken菌株在第0天革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌，在第15天變革蘭染色呈現(xiàn)出紅色球菌，第20天桿菌?？漳c彎曲菌Lulei菌株在第0天革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌，在第11天革蘭染色呈現(xiàn)出紫色球菌。
　　結(jié)論:
　　1.檢測(cè)的4株空腸彎益菌菌株在35天觀察期均進(jìn)入了活的但非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)。其中空腸彎曲菌lulei菌株的VBNC狀態(tài)在饑餓20天后進(jìn)入了活的但非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)?？漳c彎曲菌11168

12、，lc，chicken菌株VBNC狀態(tài)在25天后進(jìn)入了活的但非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)。
　　2.空腸彎曲菌11168，chicken，LC菌株在25天的觀察期其形態(tài)經(jīng)歷了桿狀與球狀相互轉(zhuǎn)化，空腸彎曲菌11168菌株在第0天革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌，到第11天可見到大部分革蘭染色呈現(xiàn)出紅色球菌，第21天開始革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌?？漳c彎曲菌Lc菌株在第0天革蘭染色呈現(xiàn)出紅色桿菌，在第10天開始革蘭染色呈現(xiàn)出紅色球狀，第14天革蘭染色呈