維生素B-,6-、C、K-,3-對肝癌細胞HepG2株生物學(xué)特性的影響及其機制研究.pdf

1、背景： 肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率高居惡性腫瘤的第二位，是目前發(fā)病率高、治療困難、預(yù)后極差的惡性腫瘤，目前我國每年約有10萬新診斷的肝癌患者，另每年約有12萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡數(shù)的45％。由于肝癌起病隱匿，絕大多數(shù)的肝癌發(fā)現(xiàn)時已是晚期而無法手術(shù)，臨床上肝癌的手術(shù)切除率僅為20％。近年來隨著肝癌介入化療的普遍開展，中晚期的肝癌患者的5年生存率有了明顯的提高。肝癌介入治療所使用的化療藥物大都具有明顯的毒副作用，

2、在作用于腫瘤組織的同時，會損傷正常的組織器官，從而造成患者肝功能、腎功能等損害，甚至危及患者生命。尋找新的高效低毒的藥物并應(yīng)用于肝癌的化療，已是擺在我國和全世界醫(yī)藥工作者面前的急需解決的一道難題維生素是一類臨床上應(yīng)用廣泛的藥物，價格低廉。已有研究表明，維生素B6、C、K3均有抑制多種腫瘤細胞生長的作用，對正常細胞幾乎無毒副作用，維生素B6可直接損傷腫瘤細胞使其壞死，維生素C、K3單藥使用可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，維生素C與K3聯(lián)用則會發(fā)生另外

3、一種死亡方式，即“胞質(zhì)自切”現(xiàn)象，這些現(xiàn)象背后的分子機制有待進一步的研究。 目的： 1.觀察維生素B6、C、K3單獨及聯(lián)合作用對人肝癌HepG2細胞的生長抑制作用，從而明確三種維生素的藥物效果。 2.從形態(tài)學(xué)上、基因表達改變上分辨凋亡與胞質(zhì)自切的差異，進一步認識胞質(zhì)自切的本質(zhì)。 3.檢測三種維生素對細胞周期及AFP含量、γ-GT活性的影響，為三種維生素應(yīng)用于肝癌治療提供理論依據(jù)。 方法：

4、1.人類肝癌細胞株HepG2的維持培養(yǎng)及擴大培養(yǎng)：用臺盼藍染色后檢測HepG2細胞活率，并選擇細胞活率在95％以上進行傳代培養(yǎng)； 2.光鏡及瑞氏染色下觀察B6、C、K3單獨及聯(lián)合作用對HepG2細胞形態(tài)學(xué)的改變；MTT法檢測各組細胞增殖抑制率差異，并選擇合適的藥物濃度和藥物作用時間進行下一步實驗。 3.流式細胞術(shù)檢測B6、C、K3單獨及聯(lián)合作用于HepG2細胞后細胞周期的變化。 4.放射免疫法測定分泌型AFP含量

5、，化學(xué)比色法測定胞漿γ-GT活性。 5.RT-PCR法檢測B6、C、K3作用后細胞P53、BCL-2、PTEN、VEGF、MMP-2mRNA水平的表達。 結(jié)果： 1.肝癌細胞生長良好，呈貼壁生長，多為長梭形，生長迅速，細胞生長密集時可多層重疊生長。 2.維生素B6、C、K3抑制HepG2細胞增殖，其抑制效應(yīng)與藥物濃度、作用時間有關(guān)；形態(tài)學(xué)改變上，呈現(xiàn)三種死亡方式，B6組表現(xiàn)為細胞壞死，高濃度C組和K3組表

6、現(xiàn)為細胞調(diào)亡，CK3聯(lián)用組則表現(xiàn)胞質(zhì)自切的形態(tài)學(xué)改變；B6與C或K3聯(lián)用對細胞增殖抑制有協(xié)同作用。 2.流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，CK3聯(lián)用組和B6CK3聯(lián)用組的Gl峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，另外，B6、C、K3單獨及聯(lián)用組的Gl期細胞比例增加，S期細胞減少，細胞被阻滯于Gl期，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 3.維生素B6、C、K3作用后HepG2肝癌細胞后分泌型AFP含量減少、除VC組外，其他各組與對照組比較差異

7、均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，γ-GT活性下降，除K3組外，其余各組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 4.RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，維生素C和K3可引起HepG2細胞P53mRNA表達升高，BCL-2，VEGF、MMP-2表達下降，呈劑量依賴性，CK3聯(lián)用組和B6CK3可使VEGF、MMP-2表達明顯下降，P53和PTENmRNA表達變化不明顯。 結(jié)論： 1.維生素B6、C、K3可抑制HepG2細胞

8、增殖，呈劑量依賴性和時間依賴性。C和K3聯(lián)用可明顯加強抑制，B6與C、K3聯(lián)用時，有協(xié)同抑制作用。 2.形態(tài)學(xué)分析，B6直接損傷細胞導(dǎo)致細胞壞死，大劑量C、K3可誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡，而CK3聯(lián)合組可使HepG2發(fā)生“胞質(zhì)自切”現(xiàn)象，進而導(dǎo)致細胞死亡?！鞍|(zhì)自切”對腫瘤細胞的抑制效果明顯。胞質(zhì)自切不伴有凋亡基因表達改變，但伴有腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因改變。 3.AFP和γ-GT是公認的反應(yīng)人肝癌細胞的增殖標(biāo)志，是觀察藥物逆轉(zhuǎn)肝