OX40-OX40L共刺激信號分子在支氣管哮喘發(fā)病機制中的研究.pdf

1、第一部分，OX40/OX40L共刺激信號分子在支氣管哮喘患者中的表達及其意義
　　 目的:探討支氣管哮喘患者外周血單個核細胞OX40、OX40L的表達和血清中sOX40L的含量及其在哮喘發(fā)病中的意義。
　　 材料與方法:采用流式細胞術測定19例健康志愿者和31例哮喘急性發(fā)作患者外周血單個核細胞中CD4+，CD8+T淋巴細胞OX40(分別為CD4+OX40+，CD8+OX40+)，單核細胞和B淋巴細胞上OX40L（分別為C

2、D14+OX40L+，CD19+OX40L+）的表達。采用ELISA方法檢測了19例健康志愿者,58例哮喘急性發(fā)作患者和24例哮喘穩(wěn)定期患者血清中sOX40L的含量。同時對所有受試者進行肺功能測定。
　　 結果:(1)哮喘急性發(fā)作組CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+的表達和sOX40L的含量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。CD8+OX40+在兩組之間的表達水平相當，差異沒有統(tǒng)計

3、學意義(P＞0.05)。(2)急性發(fā)作組sOX40L含量高于健康對照組和穩(wěn)定期組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.05)。而在哮喘急性發(fā)作患者中，sOX40L的含量與其肺功能(FEV1％Pred，F(xiàn)VC%Pred，F(xiàn)EV1FVC)存在顯著負相關（r=-0.754，r=-0.557，r=-0.457;P值均＜0.01）;并且sOX40L含量在對照組、輕度組、中度組、重度組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=4.14，p＜0.01)。
　　

4、結論:支氣管哮喘患者存在CD4+OX40+、CD14+OX40L+、CD19+OX40L+表達的上調(diào)和血清sOX40L含量的增加，并且sOX40L含量和肺功能呈顯著負相關，是反應哮喘患者病情嚴重程度的一個有價值的生物學指標，OX40/OX40L共刺激信號分子可能在哮喘的發(fā)病中具有重要意義。
　　 第二部分，OX40/OX40L共刺激信號分子在支氣管哮喘小鼠模型中的表達
　　 目的:探討OX40、OX40L分子在急性哮喘小

5、鼠動物模型中的表達，為進一步研究OX40/OX40L共刺激信號分子在哮喘發(fā)病中的機制奠定基礎。
　　 材料與方法:通過建立急性哮喘小鼠動物模型并對模型是否成功進行評價，采用流式細胞術對哮喘模型小鼠外周血單個核細胞、肺泡灌洗液細胞、肺組織中T淋巴細胞、B淋巴細胞和單核巨噬細胞表面的OX40、OX40L的表達進行分析;運用CCK8對哮喘小鼠T細胞增殖能力進行觀測;運用ELISA方法對BALF和T細胞增殖上清液中IL-4、IFN-γ的

6、含量進行檢測;同時運用免疫組化對肺組織中OX40、OX40L、t-Akt、p-Akt蛋白的表達水平進行測定。
　　 結果:(1)哮喘組小鼠具有典型哮喘發(fā)作樣癥狀;病理切片顯示肺組織及氣管周圍炎性細胞浸潤明顯;BALF中細胞總數(shù)和白細胞分類計數(shù)均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.01);在同等劑量乙酰甲膽堿(0.05、0.1、0.2mg/kg)激發(fā)時，哮喘組肺阻力（lungresistance，RL）高于對照組，而肺動態(tài)順

7、應性(dynamiccompliance，Cdyn)則低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.05)；哮喘組BALF中IL-4含量高于對照組，而IFN-γ含量低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.01）。(2)哮喘組外周血單個核細胞、肺泡灌洗液細胞、肺組織中CD4+OX40+、CD19+OX40L+、F4/80+OX40L+的表達均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.01）;而在哮喘組和對照組小鼠三種組織中，CD8+O

8、X40+的表達水平都相當，差異均無統(tǒng)計學意義（P值均＞0.05）。在哮喘組小鼠三種組織中，肺泡灌洗液和肺組織中的CD4+OX40+、CD19+OX40L+表達高于外周血，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。(3)T細胞經(jīng)Con（不加CD3）、CD3、CD3+IgG、CD3+OX40、CD3+DMSO、CD3+LY、CD3+OX40+LY處理后，哮喘組OD值均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（t值分別為34.79,52.14,48.25

9、,42.93，25.96,4.12,5.30;P值均＜0.05）。而哮喘組T細胞各處理因素之間比較，差異也有統(tǒng)計學意義(F=516.90，P＜0.01)，CD3+OX40組OD值均高于其它組（P值均＜0.01），而加用PI3K抑制劑(LY294002)處理后(CD3+LY、CD3+OX40+LY)其增殖能力明顯低于其它組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.01)。(4)哮喘組T細胞經(jīng)Con（不加CD3）、CD3、CD3+IgG、CD3+O

10、X40、CD3+DMSO、CD3+LY和CD3+OX40+LY處理后，上清液中IL-4和IFN-γ含量均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.01）。對于對照組和哮喘組來說，各處理因素之間比較，上清液中IL-4和IFN-γ的含量差異也有統(tǒng)計學意義（F值分別為31.95、34.39，109.93、62.94;P值均＜0.01），其中CD3+OX40組IL-4和IFN-γ的含量均高于其它組（P值均＜0.05），而加用PI3K抑制劑后(

11、CD3+LY、CD3+OX40+LY)其T細胞分泌IL-4和IFN-γ的能力均較CD3+OX40組減弱（P值均＜0.05）。(5)哮喘組小鼠BALF中IL-4含量明顯高于對照組，而IFN-γ含量低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（t值分別為14.31，15.28;P值均＜0.01）。(6)免疫組化分析顯示:哮喘組肺組織中OX40、OX40L、t-Akt、p-Akt蛋白表達均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。
　　

12、 結論:(1)成功建立了BALB/c小鼠急性哮喘動物模型，為后續(xù)研究奠定了堅實基礎。(2)哮喘組小鼠外周血單個核細胞、肺泡灌洗液細胞和肺組織中T淋巴細胞OX40、B淋巴細胞和單核巨噬細胞OX40L分子存在表達上調(diào)，并且肺組織中存在OX40、OX40L、t-Akt、p-Akt蛋白的高表達。(3)OX40/OX40L共刺激信號分子在T細胞體外增殖中具有重要作用，而PI3K抑制劑可以阻斷該信號介導的增殖效應。OX40/OX40L共刺激信號是

13、否通過P13K/AKT信號途徑參與哮喘的發(fā)病值得進一步深入探討。
　　 第三部分，阻斷性OX40LmAb在支氣管哮喘小鼠模型中的干預效應及其機制
　　 目的：探討OX40/OX40L共刺激信號是否通過PI3K/AKT信號途徑參與哮喘的發(fā)病。
　　 材料與方法：通過建立急性哮喘小鼠動物模型，分別采用阻斷性OX40LmAb（OX40L組）和P13K抑制劑(LY294002)（LY組）干預，并設立正常對照組(Con組)

14、、哮喘組（Asthma組）、IgG同型對照組（IgG組）和載體DMSO組（DMSO組），觀察小鼠癥狀、氣道炎癥、氣道反應性、BALF細胞計數(shù)以及白細胞分類和BALF中細胞因子的變化情況；同時采用免疫組化法對肺組織中t-Akt、p-Akt蛋白的表達水平進行分析。
　　 結果:(1)采用阻斷性OX40LmAb干預后，與Asthma組和IgG組相比，OX40L組小鼠哮喘樣癥狀相對較輕，肺部及支氣管周圍炎癥細胞浸潤減少;采用同等劑量乙酰

15、甲膽堿(0.1、0.2mg/kg)激發(fā)時，OX40L組較Asthma組RL有所降低，但仍高于正常對照組，Cdyn高于Asthma組，但仍低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.05);OX40L組BALF中細胞總數(shù)和白細胞分類計數(shù)均高于對照組，但低于Asthma組，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.01）;OX40L組BALF中IL-4含量低于Asthma組，但是明顯高于對照組，與之相反，OX40L組IFN-γ含量高于Asthma組，

16、但是低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.01）;免疫組化顯示，Con、Asthma、IgG和OX40L各組間t-Akt、p-Akt蛋白的IOD值差異均有統(tǒng)計學意義（F值分別為179.39、46.45，P值均＜0.01），而OX40L組p-Akt的IOD值高于對照組，但低于Asthma組，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。(2)采用LY294002干預后，與Asthma組和DMSO組比較，LY組小鼠哮喘樣癥狀相對較輕，肺部及

17、支氣管周圍炎癥細胞浸潤減少;采用同等劑量乙酰甲膽堿(0.1、0.2mg/kg)激發(fā)時，LY組RL低于Asthma組，但仍高于對照組，而Cdyn高于Asthma組，但仍低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.05);而LY組BALF中細胞總數(shù)和白細胞分類計數(shù)均高于對照組，但低于Asthma組，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.01）;LY組BALF中IL-4含量比Asthma組低，但是高于對照組，與之相反，LY組lFN-γ含量高于Ast

18、hma組，但是低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.01）;免疫組化結果顯示，Con、Asthma、DMSO和LY各組間t-Akt、p-Akt蛋白的IOD值差異均有統(tǒng)計學意義(F值分別為131.28、34.73，P值均＜0.01)，而LY組p-Akt的IOD值高于對照組，但低于Asthma組，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。
　　 結論:1）運用OX40LmAb和PI3K抑制劑(LY294002)對哮喘小鼠進行體內(nèi)