OX40-OX40L–NFAT信號通路與川崎病免疫損害機(jī)制的相關(guān)性研究.pdf

1、本論文包括三個(gè)部分:
　　第一部分：系統(tǒng)生物學(xué)方法整合分析川崎病相關(guān)基因及NFAT信號通路的構(gòu)建
　　目的:以系統(tǒng)生物學(xué)方法整合分析川崎病(Kawasaki disease, KD)相關(guān)基因,并構(gòu)建可能的生物信息通路,進(jìn)一步探討KD免疫損害的發(fā)生機(jī)制。
　　方法:以‖Kawasaki disease‖―Kawasaki syndrome‖―lymph node syndrome‖―mucocutaneous lymph

2、 node syndrome‖和―polymorphism‖―gene‖―genetic‖―allele‖―genotype‖等為相關(guān)檢索語言,在Pubmed、Ovid、Google Scholar數(shù)據(jù)庫中檢索與KD相關(guān)基因的文獻(xiàn),提取有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因。用DAVID軟件在基因功能、信息通路等方面對基因進(jìn)行功能注釋;用GeneGo MetaCore進(jìn)行富集分析并構(gòu)建生物信息通路;用STRING分析這些基因編碼的蛋白之間聯(lián)系。
　　

3、結(jié)果:與川崎病有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因主要涉及KD易感性、冠脈損害、不完全KD、IVIG治療無反應(yīng)、KD延遲診斷等,其中候選基因組65個(gè),全基因組關(guān)聯(lián)分析18個(gè)。DAVID軟件分析顯示這些基因的功能主要集中于損傷與防御反應(yīng)、炎癥反應(yīng)(富集分?jǐn)?shù)=15.91);細(xì)胞鈣離子平衡穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞趨化(富集分?jǐn)?shù)=3.75),免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)(富集分?jǐn)?shù)=3.58)。GO Process顯示基因的功能主要富集于免疫反應(yīng)、損傷與防御反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)等,與DAVID顯示

4、的基因功能注釋相符。GO Disease顯示,這些基因參與了皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征(即KD)、炎癥性腸病、皮膚疾病、血管炎性疾病、關(guān)節(jié)炎等免疫炎癥性疾病的病理生理過程。GO Pathway顯示,這些基因富集的通路主要集中于免疫反應(yīng)信號通路,如:HSP60和HSP70/TLF信號通路、炎性反應(yīng)信號通路、纖維蛋白溶酶信號通路、細(xì)胞核活化因子NFAT與白細(xì)胞相互作用的信號通路、樹突狀細(xì)胞中組胺信號通路等。除免疫反應(yīng)信號通路外,同時(shí)還有粘附分子信

5、號通路、生長與繁殖信號通路、凋亡與存活信號通路等。STRING顯示與KD相關(guān)的基因編碼的蛋白間密切相連,并構(gòu)成相互交錯(cuò)的信息網(wǎng)絡(luò),其中TNF-α處于網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)。
　　結(jié)論:
　　1.KD有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因間密切關(guān)聯(lián),形成眾多免疫、細(xì)胞粘附、增殖、凋亡與存活等信號通路,共同參與了KD的免疫損傷過程。
　　2.NFAT信號通路在KD的免疫損害過程中發(fā)揮了重要的作用。
　　第二部分:川崎病患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中OX

6、40、OX40L和NFAT的表達(dá)及OX40-OX40L對NFAT調(diào)控作用
　　目的:分析 OX40、OX40L及 NFAT在KD急性期的表達(dá)及其臨床意義,并探討OX40-OX40L與NFAT間的調(diào)控關(guān)系。
　　方法:1.選擇55例KD患兒,其中冠狀動(dòng)脈損傷者12例,非冠狀動(dòng)脈損害者43例。發(fā)熱及正常對照組各23例。采用Real-time PCR檢測OX40、OX40L及NFAT1、NFAT2 mRNA的表達(dá),采用wester

7、n blot檢測OX40、OX40L及NFAT1、NFAT2蛋白的表達(dá)水平。2.培養(yǎng)正常兒童及 KD患兒 PBMC,分別以刺激型 OX40抗體及抑制型OX40L抗體作用于 OX40-OX40L軸后,Real-time PCR和 western blot檢測細(xì)胞中NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1. KD組急性期治療前PBMC中NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0

8、.01);KD冠脈損傷組NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白表達(dá)高于KD無冠脈損害組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。KD治療后NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.01)。
　　2. KD組急性期治療前PBMC中OX40、OX40L mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于對照組(P<0.01);KD冠脈損傷組OX40、OX40L mRNA及蛋白表達(dá)高于KD無冠脈損害組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。治療后OX40、

9、OX40LmRNA及蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.01)。
　　3. KD組急性期PBMC中OX40、OX40L與NFAT1、NFAT2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)。
　　4.40 ug/ml anti-OX40單克隆抗體刺激正常兒童 PBMC48h,其 NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于非刺激組(p<0.01)。20 ug/m1 anti-OX40L單克隆抗體作用于KD PBMC24h,其NFAT1、NFA