內(nèi)源性光動力學結(jié)合CD基因轉(zhuǎn)染增強殺傷結(jié)腸癌細胞作用以及對細胞G-,1-期關(guān)卡因子的影響.pdf

1、光動力學療法(photodynamic therapy, PDT)已經(jīng)成為一種有效的治療癌癥的方法,但常規(guī)光敏劑副反應重和需要較長時間避光等缺點又限制了其進一步臨床應用.δ氨基酮戊酸(aminolaevulinic acid, ALA)誘導腫瘤細胞產(chǎn)生原卟啉Ⅸ來進行光動力學治療因代謝快、毒副作用小等優(yōu)點,是一種很有前途的治療癌癥的方法.我們已完成的ALA在結(jié)腸癌動物模型中的作用表明,ALA誘導的PPIX在腫瘤內(nèi)濃度明顯高于周圍正常組織,

2、PDT后可明顯殺傷癌細胞.但其作用還不夠強,增加該PDT療效是重要的研究方向之一.該研究試圖將光動力學療法與CD自殺基因轉(zhuǎn)染結(jié)合達到增強殺傷結(jié)腸癌作用的目的,同時探討光動力學對結(jié)腸癌細胞周期關(guān)卡基因Chk1、Cyclin E、Cdk2的影響,為結(jié)腸癌光動力學治療和作用機理提供依據(jù).方法:該研究在SW480結(jié)腸癌細胞培養(yǎng)的基礎上,將胞嘧啶脫氨酶(CD)基因轉(zhuǎn)染癌細胞后,再用PDT治療,探討其增效作用及對細胞周期關(guān)卡基因的影響.該研究分3個

3、部分.1.首先采用大腸桿菌將CD基因質(zhì)粒進行擴增,用酶切電泳、基因測序等進行鑒定,然后采用脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將CD基因轉(zhuǎn)染SW480結(jié)腸癌細胞,加用5-Fc后采用高效液相色譜分析技術(shù)觀察SW480/CD細胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)生5-Fu的量,用MTT法檢測細胞細胞存活率,研究殺傷作用規(guī)律.2. 激光共聚焦顯微鏡分析ALA誘導SW480結(jié)腸癌細胞內(nèi)產(chǎn)生PPIX的變化規(guī)律;MTT和流式細胞分析術(shù)用于探討ALA-PDT結(jié)合CD/5Fc自殺基因系統(tǒng)對結(jié)

4、腸癌細胞的殺傷作用以及對結(jié)腸癌細胞周期的影響及意義.3.采用RT-PCR、Western Blot、、組織細胞原位雜交、免疫組織化學等方法進行研究、探討PDT、PDT+CD/5Fc自殺基因系統(tǒng)作用后對結(jié)腸癌細胞周期關(guān)卡基因Chk1、Cdk2、CyclinE 的mRNA和蛋白的影響.結(jié)果:1.CD基因 pCMVCD質(zhì)粒經(jīng)過擴增后酶切、電泳和基因測序,所得的基因片段為所需的目的基因片段.經(jīng)過脂質(zhì)體法將CD基因轉(zhuǎn)染SW480細胞,經(jīng)過G418

5、篩選,獲得轉(zhuǎn)基因成功的SW480-CD細胞.2.加入5-Fc后4天后轉(zhuǎn)染CD基因成功的細胞培養(yǎng)液中有明顯5-Fu產(chǎn)生,未轉(zhuǎn)CD基因的細胞培養(yǎng)液中則沒有檢測到5-Fu.加入5-Fc 24小時后,相同時相高濃度組SW480-CD細胞培養(yǎng)液中產(chǎn)生的5-Fu比低濃度組明顯增加(P<0.01);加入5-Fc 12小時開始,SW480-CD細胞培養(yǎng)液中5-Fu的濃度隨時間延長逐漸增多.3.加入5-FC后,SW480細胞存活率與對照組比較無明顯變化(

6、P>0.05);SW480-CD組結(jié)腸癌細胞存活率明顯降低,其變化規(guī)律:在0.001-10mMol/ml范圍,隨5-FC濃度升高SW480-CD結(jié)腸癌細胞的存活率降低;隨5-FC加藥時間延長,SW480-CD結(jié)腸癌細胞的存活率降低.4.加入ALA后SW480細胞產(chǎn)生PPIX的量隨時間延長,PPIX量逐漸增加,加藥后8小時達最高峰,24小時后又恢復到正常細胞水平.PPIX熒光主要產(chǎn)生在細胞漿內(nèi),細胞核內(nèi)較少.SW480細胞和SW480-C

7、D細胞內(nèi)熒光強度沒有顯著差異.5.PDT結(jié)合5-Fc作用SW480-CD結(jié)腸癌細胞24小時后,與PDT組和單獨5-Fc組比,細胞存活率明顯降低(P<0.01).PDT結(jié)合5-Fc組殺傷作用曲線明顯左移.6.PDT 作用24小時后,SW480細胞G1細胞比率明顯降低(P<0.01),S期細胞比率則從12小時開始明顯升高(P<0.01).PDT結(jié)合5-Fc對SW480-CD結(jié)腸癌細胞作用后與作用前比較,各期細胞比率無明顯變化(P>0.05)

8、,但凋亡細胞比率明顯增加(P<0.01).7.PDT作用后6小時可以引起Chk1 mRNA和蛋白表達增強,12-24小時達到最高,CD/5-Fc組更明顯,且在細胞核和細胞漿內(nèi)均有表達.8.PDT作用后12小時后可以引起Cyclin E、Cdk2的mRNA和蛋白表達降低,呈時間依賴性變化.Cdk2蛋白在細胞漿和胞核均有表達,而Cyclin E蛋白36小時在胞漿內(nèi)表達較多.結(jié)論:1.將CD基因成功地轉(zhuǎn)染SW480結(jié)腸癌細胞,經(jīng)G418篩選,

9、獲取了抗性克隆,且能在癌細胞內(nèi)發(fā)揮CD基因作用.2.轉(zhuǎn)染CD基因的SW480細胞可將5-Fc轉(zhuǎn)化為5-Fu,轉(zhuǎn)化量隨著時間的延長和濃度的提高而明顯增多,未轉(zhuǎn)染CD基因的細胞則不能.5-Fc可明顯引起轉(zhuǎn)染CD基因的SW480細胞死亡,其殺傷作用有一定的濃度依賴性,可能存在"飽和"現(xiàn)象;對未轉(zhuǎn)染CD基因的細胞則沒有明顯影響.3.ALA誘導SW480細胞產(chǎn)生PPIX的量在加藥后8小時達最高峰,24小時后又恢復到正常細胞水平,PPIX熒光主要分

10、布在細胞漿內(nèi).SW480與SW480-CD細胞代謝產(chǎn)生PPIX的量和變化規(guī)律無明顯差異.4.PDT結(jié)合5-Fc可明顯增強殺傷SW480-CD結(jié)腸癌細胞作用,主要體現(xiàn)在PDT 24小時以后,殺傷作用曲線明顯左移;PDT結(jié)合5-Fc對未轉(zhuǎn)染CD基因的結(jié)腸癌細胞無增強殺傷作用.5.靜止期SW480細胞對PDT比較敏感,細胞內(nèi)PPIX量較多是原因之一;增殖期細胞相對不敏感.PDT與5-Fc結(jié)合對靜止期和增殖期癌細胞均有殺傷作用,且可明顯誘導細胞