內(nèi)源性光動(dòng)力學(xué)結(jié)合CD基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞作用以及對(duì)細(xì)胞G-,1-期關(guān)卡因子的影響.pdf

1、光動(dòng)力學(xué)療法(photodynamic therapy, PDT)已經(jīng)成為一種有效的治療癌癥的方法,但常規(guī)光敏劑副反應(yīng)重和需要較長(zhǎng)時(shí)間避光等缺點(diǎn)又限制了其進(jìn)一步臨床應(yīng)用.δ氨基酮戊酸(aminolaevulinic acid, ALA)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生原卟啉Ⅸ來進(jìn)行光動(dòng)力學(xué)治療因代謝快、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn),是一種很有前途的治療癌癥的方法.我們已完成的ALA在結(jié)腸癌動(dòng)物模型中的作用表明,ALA誘導(dǎo)的PPIX在腫瘤內(nèi)濃度明顯高于周圍正常組織,

2、PDT后可明顯殺傷癌細(xì)胞.但其作用還不夠強(qiáng),增加該P(yáng)DT療效是重要的研究方向之一.該研究試圖將光動(dòng)力學(xué)療法與CD自殺基因轉(zhuǎn)染結(jié)合達(dá)到增強(qiáng)殺傷結(jié)腸癌作用的目的,同時(shí)探討光動(dòng)力學(xué)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞周期關(guān)卡基因Chk1、Cyclin E、Cdk2的影響,為結(jié)腸癌光動(dòng)力學(xué)治療和作用機(jī)理提供依據(jù).方法:該研究在SW480結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,將胞嘧啶脫氨酶(CD)基因轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞后,再用PDT治療,探討其增效作用及對(duì)細(xì)胞周期關(guān)卡基因的影響.該研究分3個(gè)

3、部分.1.首先采用大腸桿菌將CD基因質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增,用酶切電泳、基因測(cè)序等進(jìn)行鑒定,然后采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將CD基因轉(zhuǎn)染SW480結(jié)腸癌細(xì)胞,加用5-Fc后采用高效液相色譜分析技術(shù)觀察SW480/CD細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)生5-Fu的量,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞細(xì)胞存活率,研究殺傷作用規(guī)律.2. 激光共聚焦顯微鏡分析ALA誘導(dǎo)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生PPIX的變化規(guī)律;MTT和流式細(xì)胞分析術(shù)用于探討ALA-PDT結(jié)合CD/5Fc自殺基因系統(tǒng)對(duì)結(jié)

4、腸癌細(xì)胞的殺傷作用以及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響及意義.3.采用RT-PCR、Western Blot、、組織細(xì)胞原位雜交、免疫組織化學(xué)等方法進(jìn)行研究、探討PDT、PDT+CD/5Fc自殺基因系統(tǒng)作用后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞周期關(guān)卡基因Chk1、Cdk2、CyclinE 的mRNA和蛋白的影響.結(jié)果:1.CD基因 pCMVCD質(zhì)粒經(jīng)過擴(kuò)增后酶切、電泳和基因測(cè)序,所得的基因片段為所需的目的基因片段.經(jīng)過脂質(zhì)體法將CD基因轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞,經(jīng)過G418

5、篩選,獲得轉(zhuǎn)基因成功的SW480-CD細(xì)胞.2.加入5-Fc后4天后轉(zhuǎn)染CD基因成功的細(xì)胞培養(yǎng)液中有明顯5-Fu產(chǎn)生,未轉(zhuǎn)CD基因的細(xì)胞培養(yǎng)液中則沒有檢測(cè)到5-Fu.加入5-Fc 24小時(shí)后,相同時(shí)相高濃度組SW480-CD細(xì)胞培養(yǎng)液中產(chǎn)生的5-Fu比低濃度組明顯增加(P<0.01);加入5-Fc 12小時(shí)開始,SW480-CD細(xì)胞培養(yǎng)液中5-Fu的濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多.3.加入5-FC后,SW480細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較無明顯變化(

6、P>0.05);SW480-CD組結(jié)腸癌細(xì)胞存活率明顯降低,其變化規(guī)律:在0.001-10mMol/ml范圍,隨5-FC濃度升高SW480-CD結(jié)腸癌細(xì)胞的存活率降低;隨5-FC加藥時(shí)間延長(zhǎng),SW480-CD結(jié)腸癌細(xì)胞的存活率降低.4.加入ALA后SW480細(xì)胞產(chǎn)生PPIX的量隨時(shí)間延長(zhǎng),PPIX量逐漸增加,加藥后8小時(shí)達(dá)最高峰,24小時(shí)后又恢復(fù)到正常細(xì)胞水平.PPIX熒光主要產(chǎn)生在細(xì)胞漿內(nèi),細(xì)胞核內(nèi)較少.SW480細(xì)胞和SW480-C

7、D細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度沒有顯著差異.5.PDT結(jié)合5-Fc作用SW480-CD結(jié)腸癌細(xì)胞24小時(shí)后,與PDT組和單獨(dú)5-Fc組比,細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01).PDT結(jié)合5-Fc組殺傷作用曲線明顯左移.6.PDT 作用24小時(shí)后,SW480細(xì)胞G1細(xì)胞比率明顯降低(P<0.01),S期細(xì)胞比率則從12小時(shí)開始明顯升高(P<0.01).PDT結(jié)合5-Fc對(duì)SW480-CD結(jié)腸癌細(xì)胞作用后與作用前比較,各期細(xì)胞比率無明顯變化(P>0.05)

8、,但凋亡細(xì)胞比率明顯增加(P<0.01).7.PDT作用后6小時(shí)可以引起Chk1 mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng),12-24小時(shí)達(dá)到最高,CD/5-Fc組更明顯,且在細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)均有表達(dá).8.PDT作用后12小時(shí)后可以引起Cyclin E、Cdk2的mRNA和蛋白表達(dá)降低,呈時(shí)間依賴性變化.Cdk2蛋白在細(xì)胞漿和胞核均有表達(dá),而Cyclin E蛋白36小時(shí)在胞漿內(nèi)表達(dá)較多.結(jié)論:1.將CD基因成功地轉(zhuǎn)染SW480結(jié)腸癌細(xì)胞,經(jīng)G418篩選,

9、獲取了抗性克隆,且能在癌細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮CD基因作用.2.轉(zhuǎn)染CD基因的SW480細(xì)胞可將5-Fc轉(zhuǎn)化為5-Fu,轉(zhuǎn)化量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的提高而明顯增多,未轉(zhuǎn)染CD基因的細(xì)胞則不能.5-Fc可明顯引起轉(zhuǎn)染CD基因的SW480細(xì)胞死亡,其殺傷作用有一定的濃度依賴性,可能存在"飽和"現(xiàn)象;對(duì)未轉(zhuǎn)染CD基因的細(xì)胞則沒有明顯影響.3.ALA誘導(dǎo)SW480細(xì)胞產(chǎn)生PPIX的量在加藥后8小時(shí)達(dá)最高峰,24小時(shí)后又恢復(fù)到正常細(xì)胞水平,PPIX熒光主要分

10、布在細(xì)胞漿內(nèi).SW480與SW480-CD細(xì)胞代謝產(chǎn)生PPIX的量和變化規(guī)律無明顯差異.4.PDT結(jié)合5-Fc可明顯增強(qiáng)殺傷SW480-CD結(jié)腸癌細(xì)胞作用,主要體現(xiàn)在PDT 24小時(shí)以后,殺傷作用曲線明顯左移;PDT結(jié)合5-Fc對(duì)未轉(zhuǎn)染CD基因的結(jié)腸癌細(xì)胞無增強(qiáng)殺傷作用.5.靜止期SW480細(xì)胞對(duì)PDT比較敏感,細(xì)胞內(nèi)PPIX量較多是原因之一;增殖期細(xì)胞相對(duì)不敏感.PDT與5-Fc結(jié)合對(duì)靜止期和增殖期癌細(xì)胞均有殺傷作用,且可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞