C-myc原癌基因啟動(dòng)區(qū)G-四鏈體DNA序列對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：
　　結(jié)腸癌(colorectal carcinoma)作為消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，發(fā)病率之高嚴(yán)重威脅人類健康，研究表明其發(fā)病機(jī)制與癌基因和抑癌基因的表達(dá)失調(diào)有關(guān)。隨著近年來對(duì)抗腫瘤藥物的不斷研發(fā)，基因治療已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，大量針對(duì)新作用靶點(diǎn)的抗腫瘤基因藥物被逐漸發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中，其中G-四鏈體結(jié)構(gòu)是近年來人們關(guān)注的重點(diǎn)研究對(duì)象之一。
　　G-四鏈體(G-quadruplex)由富含鳥嘌呤的核酸序列旋聚而成，基因

2、啟動(dòng)區(qū)和端粒末端可以形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，部分小分子藥物可以結(jié)合和穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)，抑制相關(guān)癌基因表達(dá)和端粒酶活性從而抑制腫瘤生長。原癌基因c-myc啟動(dòng)子區(qū)的核酸超敏元件Ⅲ1( NHEⅢ1也叫Pu27)富含鳥嘌呤可以形成分子內(nèi)G-四鏈體結(jié)構(gòu)從而沉默c-myc基因表達(dá)。
　　富含鳥嘌呤寡核苷酸序列(oligonucleotides with guanosine-rich sequences)可以形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，對(duì)于大部分腫瘤細(xì)

3、胞，一些GRO(G-rich oligonucleotide)表現(xiàn)出高效增殖抑制作用的同時(shí)降低了對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用，逐漸成為抗腫瘤治療的新型核酸藥物。Pu27序列可以在體外形成G-四鏈體，通過非轉(zhuǎn)染方式進(jìn)入白血病細(xì)胞，穩(wěn)定c-myc基因啟動(dòng)子區(qū)形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，下調(diào)c-myc基因表達(dá)抑制增殖，具有抗核酸酶及無需介導(dǎo)直接進(jìn)入細(xì)胞等其他傳統(tǒng)大分子抗癌藥物(如反義寡核苷酸等)所不具備的優(yōu)點(diǎn)。
　　觀察體外Pu27和突變體MutPu

4、27序列對(duì)結(jié)腸粘膜正常上皮細(xì)胞FHC及結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、SW480、SW620增殖與凋亡的影響；觀察體外Pu27和突變體MutPu27序列對(duì)結(jié)腸粘膜正常上皮細(xì)胞FHC及結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、SW480、SW620原癌基因c-myc表達(dá)的影響；初步研究分析體外Pu27序列抑制腫瘤增殖和基因表達(dá)的可能分子機(jī)制。
　　方法：
　　(1)閱讀文獻(xiàn)并選出核酸類抗癌藥物Pu27序列和特異G堿基突變序列MutPu27并合成；<

5、br>　　(2)以人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116、SW480、SW620和結(jié)腸粘膜正常上皮細(xì)胞FHC為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，寡核苷酸序列Pu27和MutPu27以非轉(zhuǎn)染方式進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮作用，設(shè)立HCT-116/Pu27組、HCT-116/MutPu27組、SW480/Pu27組、SW480/MutPu27組、SW620/Pu27組、SW620/MutPu27組、FHC/Pu27組和FHC/MutPu27組；
　　(3)提取上訴各個(gè)分組細(xì)胞的m

6、RNA和蛋白，熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting技術(shù)檢測c-myc基因表達(dá)水平；FHIC標(biāo)記Pu27、MutPu27序列觀察細(xì)胞的攝取以及在細(xì)胞中的穩(wěn)定情況。
　　結(jié)果：
　　(1)MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，Pu27序列對(duì)三種不同結(jié)腸癌細(xì)胞有不同程度的抑制增殖作用，其中SW480細(xì)胞組敏感性最高，可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；
　　(2)RT-PCR和Western b

7、lotting檢測表明，Pu27序列下調(diào)c-myc基因表達(dá)水平，三種不同結(jié)腸癌細(xì)胞中SW480細(xì)胞組敏感性最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；
　　(3)細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Pu27通過非轉(zhuǎn)染途徑在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞且一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。
　　結(jié)論：
　　外源性Pu27寡核苷酸序列通過非轉(zhuǎn)染方式直接進(jìn)入細(xì)胞，與正常上皮細(xì)胞FHC組相比，抑制HCT-116、SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的體外增殖并誘導(dǎo)凋亡，下調(diào)c-my