YKL-40在腦膠質(zhì)瘤生長中的作用及瘤細(xì)胞惡性演進(jìn)機(jī)理與干預(yù)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對人類危害最大的腫瘤，其惡性增殖和侵襲性生長特性是導(dǎo)致患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)后較差以及生存期短的主要原因。目前國際上普及以手術(shù)切除為主，放、化療為輔的綜合性治療措施，但仍未能從根本上遏制腫瘤的發(fā)展和提高患者的生存質(zhì)量。為了能徹底攻克這一頑疾，神經(jīng)科學(xué)工作者對膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展以及演進(jìn)機(jī)理的研究日趨深入。
　　近年來，多項臨床回顧性和前瞻性研究結(jié)果均表明,YKL-40是一種在人類惡性腫瘤中極具預(yù)后診斷價

2、值的標(biāo)記物。這一“哺乳動物甲殼酶樣蛋白”家族成員在多種局限性生長或轉(zhuǎn)移性生長的惡性腫瘤患者血清中的高表達(dá),可以揭示患者的預(yù)后不良。在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者中，血清YKL-40的表達(dá)水平同腫瘤級別與瘤荷密切相關(guān),圍繞這一主題的相關(guān)研究主要集中在對血清YKL-40的表達(dá)與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的預(yù)后，以及對術(shù)后放療的反應(yīng)性和生存質(zhì)量的分析之中。然而，對YKL-40在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生和演進(jìn)過程中所扮演的角色及涉及的相關(guān)機(jī)制還很不清楚。基于此，本研究從以下

3、幾個方面初步探討了YKL-40在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤增殖過程中的作用機(jī)理，并探尋以下調(diào)其表達(dá)為靶向的治療方式應(yīng)用于臨床的可行性。
　　1.YKL-40蛋白在WHOI-IV級腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義
　　通過收集210例WHOI～I(xiàn)V級腦原發(fā)性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織標(biāo)本,其中WHOI級11例，均為毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤(Pilocyticastrocytoma,PA)；WHOII級69例，均系彌漫型星形細(xì)胞瘤(Diffuseastrocyt

4、oma,DA)；WHOIII級62例，均系間變性星型細(xì)胞瘤(Anaplasticastrocytoma,AA)；WHOIV級68例，均為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastomamultiforme,GBM)。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測YKL-40蛋白在各級星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)，并進(jìn)一步對比分析YKL-40蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性級別的關(guān)系及其在腫瘤各類別間表達(dá)的差異性。結(jié)果顯示，YKL-40蛋白在人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，其表

5、達(dá)陽性率在WHOI～I(xiàn)V級間差異非常顯著(χ2=69.151，P=0.00<0.01)，其中I、IV級間(χ2=66.211，P=0.00<0.01)；II、IV級間(χ2=61.226，P=0.00<0.01)；III、IV級間(χ2=26.055，P=0.00<0.01)；II、III級間(χ2=9.651，P=0.002<0.01)和I、III級間(χ2=9.252，P=0.002<0.01)差異均非常顯著。其免疫反應(yīng)評分(Imm

6、unoreactivityscore,IRS)在腦膠質(zhì)瘤I～I(xiàn)V級病理級別間差異也非常顯著(P=0.000<0.01)，其中I、IV級間(P=0.00<0.01)；II、IV級間(P=0.00<0.01)；III、IV級間(P=0.00<0.01)；II、III級間(P=0.00<0.01)和I、III級間(P=0.00<0.01)差異均非常顯著；I、II級間差異顯著(P=0.029<0.05)。這說明YKL-40蛋白的表達(dá)隨膠質(zhì)細(xì)胞瘤

7、病理級別的增高而明顯升高。YKL-40蛋白在GBM中表達(dá)陽性率與IRS較星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤其它類型(PA,DA,AA)存在顯著差異(P<0.01)。對210例星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤的免疫組織化學(xué)分析結(jié)果表明,YKL-40蛋白的高表達(dá)與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的病理分級和組織分型密切相關(guān)。
　　2.YKL-40SiRNA對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外生物學(xué)功能的影響
　　首先篩選體外4種腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系:U87、U373、A172、T98及原代培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞

8、5例：Case1，Case2，Case3，Case4，Case5，其中YKL-40蛋白表達(dá)最高者為U87細(xì)胞，原代培養(yǎng)Case2和Case5細(xì)胞。實驗中進(jìn)行YKL-40SiRNA瞬轉(zhuǎn)，特異性沉默YKL-40基因，并采用WST-1法，流式細(xì)胞儀碘化丙啶染色法和Matrigel體外侵襲實驗,分別檢測YKL-40基因沉默后腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖力、瘤細(xì)胞周期分布與瘤細(xì)胞體外侵襲力的改變。WST-1檢測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，在時間窗48h，72h和96

9、h，U87-Si，Case2-Si，Case5-Si組細(xì)胞較對照組差異非常顯著(P均<0.01)。FCM碘化丙啶染色法測定細(xì)胞周期結(jié)果表明，86.59％±0.56％的U87-Si組細(xì)胞滯于G0/G1期，較U87(72.58％±0.82％)和U87-Co(74.09％±0.60％)組細(xì)胞具有顯著差異(P均<0.05)。Matrigel體外侵襲實驗中，侵襲小室經(jīng)割膜和HE染色細(xì)胞計數(shù)后發(fā)現(xiàn),U87-Si組細(xì)胞侵襲力較U87組明顯減弱，在時間

10、窗96h，侵襲細(xì)胞甚至失去正常形態(tài)，細(xì)胞呈稀疏、分散分布，并出現(xiàn)胞核固縮、濃染、碎裂等近似于細(xì)胞凋亡的征象。本研究首次證明：下調(diào)YKL-40基因表達(dá)可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外增殖和侵襲能力，推測該抑制作用與G0/G1期阻滯相關(guān)。
　　3.YKL-40SiRNA對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外生物學(xué)功能影響機(jī)制的探討
　　采用Westernblot凝膠蛋白電泳法測定腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MAPK信號通路家族各主要成員，其活性磷酸化蛋白和總蛋白(Ph

11、ospho-ERK1/2，ERK1/2；Phospho-p38，p38；Phospho-JNK1/2，JNK1/2)的表達(dá)及AKT蛋白活性形式(Phospho-AKT，p-AKT)的表達(dá)；并進(jìn)一步通過Gelshift法探索核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(NuclearfactorkappaB，NF-κB)與AP-1(Activatorprotein-1，AP-1)參與調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外增殖和侵襲的可能性。研究發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)瘤細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)YKL-40SiR

12、NA后，與細(xì)胞增殖過程密切相關(guān)的MAPKs家族成員p-ERK1/2和細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)的p-AKT的表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與此同時，MAPKs家族中與細(xì)胞凋亡關(guān)系緊密的成員p-p38和p-JNK1/2表達(dá)顯著升高(P<0.01)。提示：YKL-40基因沉默誘導(dǎo)的腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖受抑可能主要是通過下調(diào)ERK1/2和AKT信號通路的表達(dá)而實現(xiàn)的；p-p38和p-JNK表達(dá)的上調(diào)則表明腫瘤細(xì)胞凋亡活躍。而Gelshift法結(jié)果

13、則顯示，在YKL-40SiRNA瞬轉(zhuǎn)后的細(xì)胞核蛋白中，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與AP-1的表達(dá)量無明顯改變。我們認(rèn)為這可能是由于YKL-40啟動子上存在可與其它種類核轉(zhuǎn)錄因子更緊密結(jié)合位點的緣故。本研究首次證實了MAPKs及PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路參與了YKL-40基因沉默引起的膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖受抑現(xiàn)象，并間接地反映了YKL-40在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的生長過程中可能發(fā)揮的促進(jìn)增殖與凋亡回避作用。
　　4.人重組INF-α和白藜蘆醇下調(diào)YK

14、L-40表達(dá)的干預(yù)性研究
　　以熒光素酶報道基因質(zhì)粒PGV-B2為模板，成功構(gòu)建YKL-40啟動子,并將其轉(zhuǎn)染入腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，進(jìn)一步探討幾種臨床常用的化療藥物對YKL-40啟動子活性的影響。這些藥物包括：TNF-α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α,10ng/ml)、MIP-1(Macrophageinflammatoryprotein-1,MIP-1,10ng/ml)、INF-α(2000u/ml)和

15、一種具有抗癌作用的植物提取物白藜蘆醇(Resveratrol，Res)(100μM)。初步的啟動子活性測定結(jié)果顯示,TNF-α、MIP-1、INF-α和Res均可降低YKL-40啟動子的活性，但又以INF-α和Res的作用最為顯著(P<0.01)。進(jìn)而通過實時定量RT-PCR法檢測INF-α和Res對YKL-40mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果表明,經(jīng)2000u/mlINF-α作用24h、48h和72h后，YKL-40mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均降

16、低，其中尤以時間窗48h和72h更明顯,其統(tǒng)計學(xué)意義最為顯著(P<0.01)；經(jīng)100μMRes作用24h，48h和72h后，YKL-40mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，且各時間窗的統(tǒng)計學(xué)意義均非常顯著(P<0.01)。在YKL-40蛋白表達(dá)水平方面，半定量Westernblot法和定量ELISA法分別證明,2000u/mlINF-α作用24h，48h和72h后，YKL-40蛋白及分泌蛋白表達(dá)量降低，尤以48h和72h統(tǒng)計學(xué)差異最為顯著(P

17、<0.01)。而經(jīng)100μMRes作用24h，48h和72h，YKL-40蛋白及分泌蛋白表達(dá)量亦顯著下降。與實時定量RT-PCR結(jié)果相吻合的是，各時間窗的統(tǒng)計學(xué)意義均非常顯著(P<0.01)。進(jìn)一步的WST-1法與Matrigel體外侵襲實驗結(jié)果提示：100μMRes可顯著抑制U87細(xì)胞的體外增殖與侵襲能力。Westernblot凝膠蛋白電泳法結(jié)果顯示：ERK1/2信號通路參與了Res對U87細(xì)胞增殖的抑制作用；Res可降低U87細(xì)胞中

18、p-ERK1/2的表達(dá)，并與時間呈正相關(guān)關(guān)系。本研究首次證實了INF-α和Res可顯著下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中YKL-40的表達(dá)與分泌，其作用尤以Res更為突出。
　　5.白藜蘆醇抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實驗研究
　　通過MTT法觀測到Res對C6細(xì)胞具有生長抑制作用，其中在90μM-210μM的濃度范圍時，其抑制作用最為明顯；采用FCM檢測細(xì)胞周期結(jié)果證實，210μMRes作用24h后，C6細(xì)胞周期明顯滯于S期。RT-

19、PCR法及Westernblot凝膠電泳法分別檢測不同濃度Res作用24h和48h后，細(xì)胞中Caspase3mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白的表達(dá)顯示，Caspase3mRNA的轉(zhuǎn)錄水平、蛋白的活性形式及總蛋白的表達(dá)與Res作用的濃度和時間呈正相關(guān)關(guān)系。這證明了Res可抑制C6細(xì)胞的增殖并滯細(xì)胞周期于S期，同時，可通過激活Caspase3從而誘導(dǎo)C6細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外，其對正常3T3細(xì)胞的增殖無抑制作用，亦無凋亡誘導(dǎo)作用。
　　基于上述實驗