山東省貂源銅綠假單胞菌的分離鑒定及三價(jià)滅活菌對(duì)小鼠的免疫效力評(píng)價(jià).pdf

1、水貂出血性肺炎是一種由銅綠假單胞菌（PA）引起的以肺部瘀血、敗血癥為主要特征的水貂急性呼吸道傳染病。該病以地方性流行為主，發(fā)病迅速，病死率高，常造成水貂養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于該病病原菌存在廣泛，耐藥菌株較多，致使貂感染發(fā)病后藥物治療效果不佳。目前認(rèn)為，防治該病的主要措施是應(yīng)用與致病菌血清型相匹配的滅活菌進(jìn)行免疫接種。因此，水貂出血性肺炎流行地區(qū)的致病菌分離鑒定，血清型調(diào)查是制備多價(jià)滅活疫苗的前提和基礎(chǔ)。本研究開(kāi)展了山東省水貂源銅綠假

2、單胞菌的分離鑒定、病原菌血清型分布調(diào)查和三價(jià)滅活菌對(duì)小鼠的免疫效力檢測(cè)等方面的研究。
　　病原菌分離鑒定。2013年至2014年，從山東省諸城、濰坊、臨沂、文登、日照、莒縣、膠南等地區(qū)的18個(gè)養(yǎng)貂場(chǎng)共采集77份病貂肺臟樣本，分離得到120株疑似銅綠假單胞菌。經(jīng)生化試驗(yàn)、16S rDNA的PCR擴(kuò)增和血清型鑒定，最終確定其中53株分離菌為銅綠假單胞菌，分離率為44.2％(53/120)。53株銅綠假單胞菌包含11個(gè)已知血清型和一株未

3、確定型。其中G型菌株最多，有27株;其次為B型、D型，分別為5株和4株。分離菌株中主要流行血清型為G型、B型和D型。
　　免疫原的篩選。將分屬于11個(gè)血清型的15株銅綠假單胞菌分別用甲醛滅活，與佐劑混合后對(duì)新西蘭白兔連續(xù)免疫三次，采集免疫血清。用免疫血清分別與15株菌做交叉凝集試驗(yàn)，結(jié)果顯示，G型、B型、D型、N型血清與多種血清型的菌株發(fā)生凝集。依據(jù)血清型鑒定結(jié)果和血清學(xué)交叉保護(hù)結(jié)果確定可以作為水貂出血性肺炎滅活疫苗的血清型為G、

4、B、D型。通過(guò)血清交叉凝集試驗(yàn)、對(duì)小鼠半數(shù)致死量測(cè)定和生長(zhǎng)曲線測(cè)定，確定了候選疫苗株為SD004、SD050、SD052。
　　三價(jià)滅活菌免疫效力檢測(cè)。測(cè)定候選株SD004、SD050、SD052傳代穩(wěn)定性，結(jié)果顯示候選株SD004、SD050、SD052在20代內(nèi)連續(xù)傳代菌體含量雖有所變化，但都在同一數(shù)量級(jí)內(nèi)浮動(dòng);20代內(nèi)3株疫苗候選株致病性也在同一數(shù)量級(jí)內(nèi)波動(dòng)，3株候選株20代內(nèi)的生長(zhǎng)性能、致病性均穩(wěn)定;對(duì)三株疫苗株進(jìn)行包括培

5、養(yǎng)基的選擇，培養(yǎng)溫度、時(shí)間、培養(yǎng)基pH等培養(yǎng)條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)37℃條件下pH7.0～7.5的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)22～24h對(duì)候選株菌液生產(chǎn)應(yīng)用最適宜;分別用相同菌體含量不同免疫劑量的三價(jià)滅活菌免疫昆明鼠，21d后用10 LD50的候選株菌液攻毒，確定疫苗對(duì)小鼠的最小免疫劑量為0.15mL，即接種1.125×1011CFU三價(jià)滅活菌可以保證小鼠受到100％保護(hù);小鼠肺臟病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)疫苗免疫劑量的增強(qiáng)可以有效保護(hù)小鼠，預(yù)防銅綠假單胞菌的

6、感染;血清抗體水平檢測(cè)表明水貂出血性肺炎三價(jià)滅活菌免疫小鼠后在28 d血清抗體達(dá)到峰值，42 d開(kāi)始下降，49 d仍能檢測(cè)到抗體存在;同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠兩次免疫血清抗體滴度比一次免疫的抗體滴度要高，保護(hù)效果更好;將三價(jià)滅活菌0.15 mL/只免疫昆明鼠，21 d后攻毒，小鼠無(wú)一死亡，證明其受到100％免疫保護(hù)。同時(shí)剖取免疫組小鼠的肺、腎、肝等內(nèi)臟，發(fā)現(xiàn)免疫過(guò)三價(jià)滅活菌的小鼠攻毒后小鼠內(nèi)臟無(wú)明顯病理學(xué)變化，進(jìn)一步證明三價(jià)滅活菌可以對(duì)小鼠提供有