寒濕及濕熱環(huán)境與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)自身抗體表達(dá)特征的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究胡蔭奇主任醫(yī)師指導(dǎo)下，在大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的基礎(chǔ)上，給與CCP多肽抗原免疫動(dòng)物，使大鼠發(fā)生佐劑性關(guān)節(jié)炎的同時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生抗環(huán)瓜氨酰多肽抗體，大鼠體內(nèi)產(chǎn)生CCP抗體的免疫反應(yīng)過(guò)程可能類似于RA的發(fā)病過(guò)程，在此基礎(chǔ)上給予不同的環(huán)境因素刺激，并檢測(cè)AKA，APF，RA33，anti-CCP和RF表達(dá)水平，研究環(huán)境因素與自身抗體表達(dá)的關(guān)系以及自身抗體表達(dá)與實(shí)驗(yàn)大鼠關(guān)節(jié)病理改變以及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)系，為臨床及時(shí)早期確定那些有可能發(fā)展成頑固

2、的，嚴(yán)重的病例提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)探討RA寒濕痹阻及濕熱閉阻病證結(jié)合動(dòng)物模型的建立方法?！　?shí)驗(yàn)方法：適齡雌性的健康SD大鼠32只，隨機(jī)分成4組，每組8只；依照隨機(jī)表法分為正常對(duì)照組(正常組)，佐劑+CCP抗原組(模型組)，佐劑+抗原+寒濕環(huán)境組(寒濕組)，佐劑+CCP抗原+濕熱環(huán)境組(濕熱組)，模型組：使用人工合成的CCP多肽抗原100～150μg與完全福氏佐劑0.1ml混合后對(duì)一組大鼠雙側(cè)足底部注射；隔2周，尾尖取血1ml制備血清備

3、用，4周后心臟穿刺抽血4～6ml，制備血清備用；濕熱組：除與模型組相同處理以外，在接受免疫后1～9天，每天在人工氣候箱內(nèi)接受濕熱刺激一次，每次持續(xù)1小時(shí)，相對(duì)濕度95％～100％，溫度30～33℃；寒濕組：除與模型組相同處理以外，在接受免疫后1～9天，每天在人工氣候箱內(nèi)接受寒濕刺激一次，每次持續(xù)1小時(shí)，相對(duì)濕度95％-100％，溫度7-10℃；正常組：不做任何處理，與以上各組同時(shí)心臟穿刺取4～6ml血，制備血清備用；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取雙側(cè)踝

4、關(guān)節(jié)，40％多聚甲醛固定備用。 結(jié)果：一般情況：第一周：寒濕組大鼠明顯畏寒，蜷臥少動(dòng)，大便時(shí)軟時(shí)溏；濕熱組大鼠躁動(dòng)汗出，呼吸心跳加快，飲水量增加；模型組大鼠活動(dòng)量減少，飲食及其他情況正常；正常組大鼠活動(dòng)，飲食及其他情況均正常。第二周～第四周，寒濕組大鼠明顯蜷臥少動(dòng)，萎靡不振，行動(dòng)遲緩，反應(yīng)遲鈍，跖趾部體毛脫落，食量減少，大便時(shí)軟時(shí)溏；濕熱組大鼠由躁動(dòng)逐漸變?yōu)榛顒?dòng)量減少，萎靡不振，反應(yīng)遲鈍，倦怠汗出，體毛失去光澤，關(guān)節(jié)紅腫較甚，個(gè)別

5、大鼠出現(xiàn)跖底部潰瘍，飲水量較第一周減少，但仍比其余各組飲水量多，部分大鼠大便軟，偶有便溏，部分大鼠大便干燥；模型組大鼠體毛失去光澤，飲食量稍有減少，活動(dòng)及大便等均正常?！　∮^察前，6，12，18，24，30天各組體重檢測(cè)結(jié)果，正常組隨時(shí)間的推移體重逐漸增加，造?；蛟炷＜雍疂窕驖駸岘h(huán)境從試驗(yàn)第18天起可明顯影響體重的正常增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中濕熱環(huán)境對(duì)體重的影響最明顯，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)，影響程度逐漸加重，而模型組和寒濕組對(duì)大鼠體重的影響趨于平穩(wěn)，

6、無(wú)繼續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)?！　∮^察前，6，12，18，24，30天各組雙側(cè)后肢跖趾厚度檢測(cè)結(jié)果，造模從試驗(yàn)第6天起對(duì)大鼠雙側(cè)后肢跖趾厚度具有非常顯著性影響，濕熱和寒濕環(huán)境更加重了對(duì)大鼠右后跖趾厚度的影響，且隨著時(shí)間的推移，這種影響逐漸加重，濕熱環(huán)境雖然有影響更為嚴(yán)重的趨勢(shì)，但濕熱和寒濕環(huán)境之間無(wú)顯著性差異?！　≡囼?yàn)各組血清免疫球蛋白檢測(cè)結(jié)果，試驗(yàn)2周末造模及造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能明顯提高血清IgA，IgM，IgG等三種免疫球蛋白的水平，且濕

7、熱環(huán)境對(duì)IgA，IgM血清水平的提高作用更顯著，而寒濕環(huán)境則對(duì)IgG血清水平的提高有更顯著影響；試驗(yàn)1月末造模及造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能明顯提高大鼠血清IgA，IgM，IgG等三種免疫球蛋白的水平，但濕熱和寒濕環(huán)境對(duì)IgA，IgM，IgG血清水平的提高無(wú)明顯影響作用；造模加濕熱環(huán)境能使大鼠血清IgM水平在2周末達(dá)到高峰后，在1月末又顯著降低；造模加寒濕環(huán)境及單純?cè)炷＞苁勾笫笱錓gM水平2周末達(dá)到高峰后，在1月末雖有下降趨勢(shì)但均無(wú)顯著

8、性意義；2周末與1月末正常組IgM，試驗(yàn)各組IgG和IgA血清水平的變化無(wú)顯著性差異?！　≡囼?yàn)各組血清ASO檢測(cè)結(jié)果，試驗(yàn)2周末，造模加濕熱環(huán)境能顯著升高大鼠血清ASO水平，但單純?cè)炷＜霸炷＜雍疂癍h(huán)境對(duì)大鼠血清ASO水平均無(wú)明顯升高作用；試驗(yàn)1月末，造模加濕熱環(huán)境能顯著升高大鼠血清ASO水平，但單純?cè)炷＜霸炷＜雍疂癍h(huán)境對(duì)大鼠血清ASO水平均無(wú)明顯升高作用；造模加濕熱環(huán)境使大鼠血清ASO水平在2周末明顯升高并達(dá)到高峰后，在1月末又稍有下

9、降趨勢(shì)，但下降幅度無(wú)顯著性意義(P＞0.05)；造模及造模加寒濕環(huán)境在1月末也均可使大鼠血清ASO水平稍有下降趨勢(shì)，但下降幅度也均無(wú)顯著性意義(P均＞0.05)，正常組2周末與1月末2周末與1月末ASO血清水平的變化無(wú)顯著性差異?！　≡囼?yàn)各組血清RF檢測(cè)結(jié)果，試驗(yàn)2周末，造模及造模加寒濕或濕熱環(huán)境均能顯著升高大鼠血清RF水平，且造模加寒濕或濕熱環(huán)境對(duì)大鼠血清RF的影響均明顯高于單純?cè)炷＝M，但寒濕或濕熱環(huán)境之間無(wú)顯著性差異；試驗(yàn)1月末，

10、造模及造模加寒濕或濕熱環(huán)境均能顯著升高大鼠血清RF水平，但造模加寒濕或濕熱環(huán)境對(duì)大鼠血清RF水平的影響不明顯；造模加濕熱或寒濕環(huán)境能使大鼠血清RF水平在2周末達(dá)到高峰后，在1月末又顯著降低，但濕熱與寒濕環(huán)境之間無(wú)顯著性差異；單純?cè)炷Ｊ勾笫笱錜F水平2周末達(dá)到高峰后，在1月末無(wú)明顯回落趨勢(shì)；正常組血清RF水平不隨時(shí)間的變化而改變?！　≡囼?yàn)各組血清CRP檢測(cè)結(jié)果，試驗(yàn)2周末，造模及造模加寒濕或濕熱環(huán)境均能顯著升高大鼠血清CRP水平，且造

11、模加濕熱環(huán)境對(duì)大鼠血清CRP的影響明顯高于造模加寒濕環(huán)境及單純?cè)炷＝M，造模加寒濕環(huán)境對(duì)大鼠血清CRP的影響也明顯高于單純?cè)炷＝M；試驗(yàn)1月末，造模及造模加寒濕或濕熱環(huán)境均能顯著升高大鼠血清CRP水平，且造模加濕熱環(huán)境對(duì)大鼠血清CRP的影響明顯高于造模加寒濕環(huán)境及單純?cè)炷＝M，造模加寒濕環(huán)境對(duì)大鼠血清CRP的影響也明顯高于單純?cè)炷＝M；造模及造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能使大鼠血清CRP水平在2周末達(dá)到高峰后，在1月末又顯著降低，但CRP降低的幅度三

12、種處理因素之間無(wú)顯著性差異；正常組血清CRP水平不隨時(shí)間的變化而改變?！　≡囼?yàn)各組血清anti-CCP，RA33，APF，AKA檢測(cè)結(jié)果，試驗(yàn)2周末，造模以及造模加寒濕或濕熱環(huán)境均能顯著升高大鼠血清CCP抗體水平，其中造模加寒濕或濕熱環(huán)境對(duì)大鼠血清CCP抗體的影響均明顯高于單純?cè)炷＝M，但兩種環(huán)境之間無(wú)顯著性差異；試驗(yàn)1月末，造模以及造模加寒濕或濕熱環(huán)境均能顯著升高大鼠血清CCP抗體水平，其中造模加寒濕或濕熱環(huán)境對(duì)大鼠血清CCP抗體的影

13、響均明顯高于單純?cè)炷＝M，但兩種環(huán)境之間無(wú)顯著性差異；試驗(yàn)2周末，造模加濕熱環(huán)境能顯著升高大鼠血清RA33水平；單純?cè)炷＜霸炷＜雍疂癍h(huán)境對(duì)大鼠血清RA33的影響雖然有升高趨勢(shì)，但與正常組之間無(wú)顯著性差異；試驗(yàn)1月末，造模及造模加寒濕或濕熱環(huán)境均能顯著升高大鼠血清RA33水平，但三種處理因素之間無(wú)顯著性差異；試驗(yàn)2周末，造模及造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能使大鼠血清APF的陽(yáng)性程度明顯高于正常組，但三種處理因素之間無(wú)顯著性差異；試驗(yàn)1月末，造模及

14、造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能使大鼠血清APF的陽(yáng)性程度明顯高于正常組，其中造模加濕熱環(huán)境的陽(yáng)性程度最高，造模加寒濕環(huán)境次之，但與單純?cè)炷o(wú)顯著性差異?！　≡囼?yàn)1月末VEGF，IL-1陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果，造模及造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能明顯增大大鼠VEGF，IL-1陽(yáng)性細(xì)胞平均面積，但三種處理因素之間無(wú)顯著性差異，造模及造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能顯著增大大鼠VEGF，IL-1陽(yáng)性細(xì)胞MOD，且造模加濕熱環(huán)境對(duì)大鼠VEGF，IL-1陽(yáng)性細(xì)胞MOD的

15、影響明顯高于造模加寒濕環(huán)境及單純?cè)炷＝M，造模加寒濕環(huán)境對(duì)大鼠VEGF，IL-1陽(yáng)性細(xì)胞MOD的影響也明顯高于單純?cè)炷＝M；造模及造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能顯著增多大鼠VEGF，IL-1的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，造模加濕熱環(huán)境對(duì)大鼠VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響明顯高于造模加寒濕環(huán)境及單純?cè)炷＝M，造模加寒濕環(huán)境對(duì)大鼠VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響也明顯高于單純?cè)炷＝M；造模加濕熱或寒濕環(huán)境對(duì)大鼠IL-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響明顯高于單純?cè)炷＝M，但濕熱或寒濕環(huán)境之間對(duì)大鼠IL

16、-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響無(wú)顯著性差異?！　E染色病理結(jié)果，正常組關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常，滑膜組織無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞無(wú)增生，骨及軟骨結(jié)構(gòu)正常；模型組關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)基本正常，滑膜細(xì)胞增生不明顯，骨及軟骨結(jié)構(gòu)基本正常；寒濕組可見(jiàn)滑膜組織增生，可見(jiàn)3～4層排列不規(guī)則的滑膜細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，骨小梁稀疏，髓腔擴(kuò)大；濕熱組滑膜細(xì)胞增生明顯，可見(jiàn)數(shù)層排列不規(guī)則的滑膜細(xì)胞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，骨小梁稀疏斷裂，排列不規(guī)則?！　〗Y(jié)論：環(huán)境因素使動(dòng)物模型具有某些證候的某些

17、特征，可以作為制作中醫(yī)證候模型的手段之一。濕熱環(huán)境和寒濕環(huán)境對(duì)AA的影響，有顯著性差異，濕熱組動(dòng)物一定程度上表現(xiàn)出了濕熱閉阻證的特征，如關(guān)節(jié)紅腫，甚至潰爛，多動(dòng)，汗出，飲水量增加，呼吸急促，便干等；而寒濕環(huán)境對(duì)AA大鼠的影響也有寒濕痹阻證的某些特點(diǎn)，如關(guān)節(jié)腫脹，畏寒(相互擁擠在一起并鉆入墊料下取暖)，蜷臥少動(dòng)，大便時(shí)軟時(shí)溏等；環(huán)境因素加重了動(dòng)物模型的自身免疫反應(yīng)，使病情加重。環(huán)境因素嚴(yán)重影響Ig，RF，CRP，anti-CCP，APF，

18、AKA以及VEGF和IL-1陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，并加重了關(guān)節(jié)滑膜增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)骨質(zhì)稀疏骨小梁斷裂?！　駸岘h(huán)境對(duì)IgA，IgM，RF，CRP，anti-CCP，APF，AKA，RA33以及VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，MOD值，IL-1陽(yáng)性細(xì)胞MOD值的影響比寒濕環(huán)境更嚴(yán)重，濕熱環(huán)境對(duì)關(guān)節(jié)病理學(xué)影響也較寒濕組嚴(yán)重，而寒濕環(huán)境對(duì)大鼠血清IgG影響更為顯著?！　『疂癍h(huán)境與濕熱環(huán)境對(duì)RF，anti-CCP，VEGF和IL-1陽(yáng)性細(xì)胞面積以