新型自殺基因系統(tǒng)修飾供者T細(xì)胞防治移植物抗宿主病的研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士研究生學(xué)位論文 中文摘要中文摘要本研究建立了逆轉(zhuǎn)錄病毒( R V ) 介導(dǎo)針對(duì)人原代T 細(xì)胞的高效基因?qū)牒秃Y選平臺(tái)，利用這個(gè)平臺(tái)將2 個(gè)新型自殺基因一一紅色酵母D ．氨基酸氧化酶基因( D A A O ) 和釀酒酵母胞嘧啶脫氨酶基因( Y C D ) 導(dǎo)入人原代T 細(xì)胞和小鼠T 細(xì)胞系P 3 8 8 等，在體外和體內(nèi)分別證明了D A A O 和Y C D 自殺基因體系的有效性，還進(jìn)行了帶有熒光蛋白基因標(biāo)記的D A A

2、O ．e G F P 和Y C D —R F P 轉(zhuǎn)基因小鼠建系研究。第一部分：構(gòu)建新的D A A O 和Y C D 載體。原有的D A A O 和Y C D 載體( p L D F G 、p M S C V - D A A O ．I R E S ．e G F P 和p M S C V - Y C D ．I R E S —e G F P ) ，由于無法獲得高滴度的R V 以及用流式細(xì)胞術(shù)( F A C S ) 難以分選e G F P +

3、 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，無法滿足課題設(shè)計(jì)的要求，因此作者重新構(gòu)建了具有嘌呤霉素( P u r o m y c i n ) 抗性基因的小鼠干細(xì)胞自血病病毒( M S C V ) 載體——刊ⅥS C v - D A A O ．p u r o 和p M S C V - Y C D - p u r o 載體經(jīng)酶切、測序鑒定正確。同時(shí)建立了批量快速重組病毒滴度測定法( L a S R T ) 等實(shí)用新技術(shù)。第二部分：建立人T 細(xì)胞高效基因?qū)肫脚_(tái)。利用病毒

4、包膜不同的穩(wěn)定和瞬時(shí)R V 包裝細(xì)胞“乒乓感染”、包裝細(xì)胞篩選和引入水泡性口膜炎病毒G 蛋白( V S V - G )改造病毒包膜等方法，建立了高滴度、高感染力的R V 生產(chǎn)體系；并探討了部分提高R V 的滴度和基因?qū)肼实姆椒ê蜋C(jī)制。通過高速離心富集R V 、C H ．2 9 6 包被+離心感染和流動(dòng)轉(zhuǎn)染法等，對(duì)經(jīng)高效擴(kuò)增的人原代T 細(xì)胞感染率可達(dá)4 0 ．5 ％。第三部分：D A A O 和Y C D 基因?qū)肴薚 細(xì)胞及體外研究。

5、利用第二部分建立的高效基因?qū)肫脚_(tái)，將D A A O 和Y C D 導(dǎo)入擴(kuò)增第4 d 的人T 細(xì)胞，第6 d 加入P u r o m y c i n 篩選，3 d 后撤藥繼續(xù)擴(kuò)增，第1 4 d 時(shí)1 0 m L 外周血可獲得1 ．3 ×1 0 8 轉(zhuǎn)基因T 細(xì)胞，較起始細(xì)胞量擴(kuò)增了2 4 倍；體外實(shí)驗(yàn)D A A O 和Y C D 轉(zhuǎn)基因T 細(xì)胞可分別被2 0 m m o l ／LD ．A l a 和2 5 l am o l ／

6、L5 - F C 全部殺傷；篩選出的轉(zhuǎn)基因T 細(xì)胞對(duì)K 5 6 2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用及細(xì)胞因子分泌功能無顯著變化。作者認(rèn)為，p M S C V - D A A O ．p u r o和p M S C V - Y C D ．p u r o 載體，比帶N e o R 或e G F P 篩選基因的載體更具臨床應(yīng)用前景。第四部分：Y C D ／5 ．F C 體系的體內(nèi)研究。( 1 ) 將P 3 8 8 ．Y C D ．e G F P 細(xì)胞、P 3

7、8 8 一e G F P細(xì)胞和P 3 8 8 細(xì)胞，按5 X 1 0 6 ，只，分別接種于Y C D 組、e G F P 組和w t P 3 8 8 組D B A小鼠腹腔，1 d 后5 ．F C 腹腔治療5 1 ．t m o l ／d ×2 w ，Y C D 組小鼠存活1 7 ．8 + 1 ．8 9 d ，而e G F P組和w t P 3 8 8 組分別存活7 ．8 1 1 ．1 0 d 和7 ．7 + 1 ．1 5 d (

8、 P < 0 ，0 5 ) 。( 2 ) 由于D B A 小鼠的死亡時(shí)間同體內(nèi)P 3 8 8 腫瘤細(xì)胞數(shù)量相關(guān)性良好，另一組實(shí)驗(yàn)中，5 ．F C 5 u m o l ／d ×2 d治療后，Y C D 組小鼠存活1 3 ．3 1 2 ．3 6 d ，推算5 - F C 治療2 d 對(duì)P 3 8 8 一Y C D - e G F P 的殺傷率達(dá)9 9 ．6 ％。( 3 ) 給D B A 小鼠靜脈按種P 3 8 8 ．Y C

9、D —e G F P 細(xì)胞，5 ×1 0 6 ／只，1 d后分別給予5 - F C 和P B S 治療，P B S 對(duì)照組外周血中e G F P + 細(xì)胞的比例持續(xù)增高，5 ．F C 治療組經(jīng)2 0 u m o l5 - F C 治療2 4 h 后，e G F P + 細(xì)胞的比例從2 1 ．9 ％±1 6 ．0 9 ％降至5 ．4 ％±5 ．6 ％．( 4 ) 利用人T 細(xì)胞／S C I D 小鼠嵌合模型，

10、將人T ．Y C D - p u r o 細(xì)胞經(jīng)6第二軍醫(yī)大學(xué)博士研究生學(xué)位論文 英文摘要A b s t r a c tA l l o g e n i ch e m a t o p o i e t i cs t e mc e l lt r a n s p l a n t a t i o n ( a t I o H S C T ) i st h em o s te f f i c i e n tt r e a t m e n tf o r

11、h e m a t o l o g i c a lm a l i g n a n c i e sa n ds o m es o l i d t L U r l O r S ．A l l o g e n i cd o n o rTl y n p h o c y t e s a r e a l s o u s e d f o r t r e a t m e n t o f r e l a p s e o r l y m p h o m a

12、a s s o c i a t e d w i t hE p s t e i n - B a r r v i r u s i n f e c t i o n p o s t t r a n s p l a n t a t i o n ．B u t t h e g r a f t v e r s u s h o s t d i s e a s e( G V H D ) i n d u c e d b ya l l o g e n i ci

13、 m m u n e c e l l si s o n eo f t h em a j o rc a u s e so f m o r t a l i t yi na 1 1 0 ．H S C TS p e c i f i ca n d c o n d i t i o n a li nv i v oa b l a t i o no f a t l o r e a c t i v ed o n o r T c e l l sa f i e

14、 ra l l o H S C Tc o u l ds i g n i f i c a n t l y c o n t r i b u t et op r e v e n t i n ga n d t r e a t i n gG V H D ．T h e u s e o f d o n o r T c e l l se x p r e s s i n ga ”s u i c i d e ”g e n eh a st h ep o t

15、e n t i a lo fa c h i e v i n gs u c hag o a l ．H e r p e ss i m p l e xv i r e s 1 t h y m i d i n ek i n a s e ( H S V - T K ) h a s b e e nu s e df o rt h a tp u r p o s e ．S i n c et h ep r o - d r u gg a n c i c l o

16、 v i r ( G C V ) i sw i d e l yu s e d f o rp r e v e t i o na n d t r e a t m e n to f c y t o m e g l o v i r u s ( C M V )i n f e c t i o n ．w h i c h i s a c o m l T l O n a n d f e t a l c o m p l i c a t i o n i n

17、a l l o H S C T ，i t w i l l b e a ne m b a r r a s s i n gs i t u a t i o nw h e nu s i n gp r o d r u gG C V i np a t i e n t s 、Ⅳi t } 1C M V i n f e c t i o nw h ow a sg i v e nH S V - T K - e x p r e s s i n gT c e

18、l l s ．N e ws u i c i d eg e n es y s t e m ss h o u l db ee x p l o r e da c c o r d i n g l y ．R ．g r a c i l i s D - a m i n o a c i d o x i d a s e ／D - a l a n i n e ( D A A O ／D —A l a ) a n d Y e a s tc y t o s i

19、n ed e a m i n a s e ／5 一f l u o r o c y t o s i n e ( Y C D ／5 - F C ) a r es u c hn o v e ls u i c i d eg e n es y s t e m si n v e s f i g a t e di nt h i sp r o j e c t ．T o r e a c ht h eg o a l ，t h ee xv i v ob ．i

20、 g h l ye f f i c i e n tr e t r o v i r a l - m e d i a t e dg e n e t r a n s f e ri m oh u m a nT c e l l sa sw e l la sp r o —d r u gs e n s i t i v i t yo f s u c hg c n e —m o d i f i e dT c e l l ss h o u l db ee

21、s t a b l i s h e d ．F u r t h e rm o r e ，t h es u i c i d eg e n em o d i f i e dh u m a n Tc e l l ss h o u l dr e t a i n f u l li m m u n e f u n c t i o na n d c a n b ee x p a n d e d t ob e e n o u g h i nn u m b

22、 e r f o rc l i n i c a lu s e ．o b j e c t i v e ：1 ．T oe s t a b l i s he f f i c i e n tt e c h n o l o g i e st oi n t r o d u c ef o r e i g ng e n e si n t op r i m a r y h u m a nT c e l l sa n d t oq u i c k l y

23、—s e l e c t p o s i t i v ec e l l so u t ．2 ．T ot r a n s f e rD A A O a n dY C D i n t o h u m a np r i m a r yT c e l l sr e s p e c t i v e l y ，a n dt od e t e r m i n ei f t h e t w o n o v e l s u i c i d eg e n

24、es y s t e m sd o w o r k e x v i v oa n di nv i v o ．3 T o e s t a b l i s ho f t r a n s g e n i c m i c e b a r i n gD A A O ·e G F P a n d Y C D —R F P g e n e ．M e t h o d s a n d l I e s u I t s ：1 ．T h r e er

25、 e t r o v i r u s ( R V ) p l a s m i d s ：p L D F Ga n dp M S C V - D A A O - I R E S ‘e G F P ( b o t hc o n t a i n i n gD A A O g e n e ，b u tw i t hd i f f e r e n t b a c k b o n e ) a n dp M S C V - Y C D - I R E

26、 S ‘e G F Pw e r es t u d i e d ，b u tn o n eo f t h e mc a ng e te n o u g hr e t r o v i r u ss t o c k sf o rp r i m a r yh u m a n Tc e l l s ．T h e n2n e w p l a s m i d so fD A A O a n dY C D w e r ec o n s t r u c

27、 t e d ．D A A Og e n ew a so b t a i n e d b y P C R f r o m p l a s m i d p L D F G , Y C D g e n e w a s o b t a i n e d b y X h o Y E c o R Id o u b l ee n z y m e d i g e s t i o nf r o m p l a s m i d p M S C V - Y