刀豆蛋白致小鼠免疫性肝損傷MAPEG家族表達譜及環(huán)孢素調(diào)控.pdf

1、肝臟損傷是一個復(fù)雜的病理過程，涉及眾多炎癥介質(zhì)和致病因素。在許多肝病發(fā)生發(fā)展過程中都涉及了病理性免疫反應(yīng)，而多年來所應(yīng)用的實驗肝損害模型(如細(xì)菌脂多糖、D-氨基半乳糖所介導(dǎo)的肝損害)，尚不能很好地反映這一病理特點，因此探索免疫性肝損傷代表性較好的病理模型，無論對病理過程理解還是確認(rèn)藥物靶標(biāo)均具有重要意義。1992年，Tiegs應(yīng)用刀豆蛋白(Concanavalin A,ConA)誘發(fā)小鼠特異性肝損傷，被證實是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性肝損

2、害，因而被廣泛應(yīng)用于肝細(xì)胞損害的細(xì)胞與分子生物學(xué)機制以及藥物篩選的研究。 在對肝臟損傷機理的深入研究中。發(fā)現(xiàn)花生四烯酸代謝產(chǎn)物作為一類具有重要生物活性的脂類前體物質(zhì)，在調(diào)節(jié)肝臟生理和病理過程中起著重要作用。并且，隨著花生四烯酸代謝通路中各種相關(guān)酶的發(fā)現(xiàn)，尤其是涉及谷胱甘肽與類花生酸代謝相關(guān)的膜結(jié)合蛋白超家族(membrane associated proteins cicosaaoid andglutathione metabo

3、lism,MAPEG superfamily)成員結(jié)構(gòu)與功能確定，花生四烯酸代謝調(diào)控及其炎性終產(chǎn)物與各種肝損傷間相關(guān)研究已引起關(guān)注，但是與免疫性肝損傷問的關(guān)聯(lián)性仍遠(yuǎn)未闡明。因此，本研究采用ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷，觀察了花生四烯酸代謝通路中相關(guān)代謝酶MAPEG家族在免疫性肝損傷中的表達，并進一步研究了其與細(xì)胞因子和：MAPK信號通路之間的聯(lián)系。此外，尚應(yīng)用免疫抑制劑環(huán)孢素(eyelosporin A CsA)預(yù)給藥，特異性抑制ConA造成

4、的肝損傷，并從產(chǎn)物和蛋白水平探討了白三烯通路是否涉及了免疫抑制劑對于免疫性肝損傷的保護過程。 第一部分刀豆蛋白致小鼠肝損傷中MAPEG家族表達譜與花生四烯酸代謝目的：研究刀豆蛋白(ConA)誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷中花生四烯酸終端產(chǎn)物PGE2和eysLTs的變化，及其代謝通路中MAPEG家族成員表達譜。 方法：雄性Balb/c小鼠，體重20±2g，隨機分為5組，每組6只。除陰性對照組尾靜脈注射生理鹽水外，其他均尾靜脈注射Co

5、nA(20 mg/kg)造模，分別在造模后1，2，6，8 h處死動物并收集生物樣本。以血清ALT、AST和HE染色組織病理改變作為肝損傷指標(biāo)。同時以ELISA法檢測肝臟cysLTs含量，及其血清相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ：RIA法檢測肝臟PGE2含量。RT-PCR法檢測MAPEG家族mPGES，mGST2，mGST3和LTC4S的mRNA表達，免疫組化法檢測MGST2的表達，Westem blot法檢測mPGES，mGST3和T

6、C4s及MAPK信號通路的表達情況。結(jié)果：ALT、AST和HE病理結(jié)果顯示尾靜脈注射ConA后2h即出現(xiàn)肝損傷,之后損傷程度加深，8 h達到高峰；ConA損傷早期，肝臟cysLTs含量顯著上升，隨后緩慢下降，而PGE2變化不顯著；基因和蛋白水平的檢測結(jié)果顯示各時間點mPGES變化不大，而LTC4S，mGST2和mGST3的表達隨時間延長而增強；其他MAPEG家族相關(guān)成員中，5-LO、FLAP和cysLTlR蛋白表達在2～6 h達到高峰，

7、8 h后恢復(fù)至正常水平；另外，Con A肝損傷中的兩個最重要的細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ均在Con A肝損傷的早期呈一過性升高，而MAPK通路中的P-ERK、p-p38和p-JNK等變化也主要出現(xiàn)在肝損傷早期。 第二部分環(huán)孢素保護小鼠刀豆蛋白肝損傷MAPEG家族表達改變及其產(chǎn)物cysLTs含量變化目的：探討環(huán)孢素(CsA)保護小鼠免疫性肝損傷過程中，是否涉及了白三烯通路改變，及其對MAPEG家族表達的影響。 方法：雄

8、性Balb/c小鼠隨機分為5組，陰性對照組尾靜脈注射生理鹽水；尾靜脈注射Con A(20 mg/kg)2 h、8 h制備小鼠免疫性肝損傷早、晚期模型；另設(shè)造模前15 h和1 h兩次尾靜脈注射CsA(100 mg/kg)，之后分別注射生理鹽水和Con A(20mg/kg)，2h和8h后處死，為CsA單用組和CsA/ConA組。血清ALT、AST和HE染色組織病理改變作為肝損傷指標(biāo)，ELISA法檢測肝臟cysLTs含量，Westem blo

9、t法檢測MAPEG家族變化。 結(jié)果：CsA預(yù)給藥有效改善了Con A引起的肝臟損傷，使血清ALT、AST顯著下降,并抑制cysLTs表達增加；CsA預(yù)給藥尚能抑制ConA引起的mGST3和5-LO表達升高，但對LTC4S，F(xiàn)LAP和cysLT1R表達升高的抑制不明顯。 全文結(jié)論： l、ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷過程，伴有cysLTs表達增加，F(xiàn)LAP、LTC4S、mGST2和mGST3基因/蛋白表達上調(diào)，而對mPGE

10、S基因/蛋白表達無明顯影響;CsA預(yù)給藥可有效抑制肝損傷，并減少cysLTs的表達增加，降低mGST3的表達上調(diào)，但對FLAP和LTC4S表達的影響不大。 2、ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷過程增強了5-LO和cysLTlR的表達，而CsA預(yù)給藥可降低ConA引起的5-LO表達升高，但對cysLT1R表達升高的抑制不明顯。 3、ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷過程中，MAPK通路率先激活，介導(dǎo)了兩大細(xì)胞因子TNFα、IFNγ的表達增加，推