環(huán)孢素A降尿蛋白的非免疫性機制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 蛋白尿既是腎臟損傷的標(biāo)志和臨床治療指標(biāo),也是腎小球疾病向小管損傷、間質(zhì)纖維化進(jìn)展并最終發(fā)展為尿毒癥期的重要危險因素。腎小球血液濾過屏障自內(nèi)到外依次包括:①內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的孔窗結(jié)構(gòu)；②高度水化膠原成分的腎小球基底膜(glomerular basement merebrane,GBM)；③足細(xì)胞足突及由其構(gòu)成的裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)。作為腎小球血液濾過功能的最后屏障,足細(xì)胞(podocyte)

2、的改變幾乎參與了所有的蛋白尿相關(guān)性腎病的發(fā)生,并在蛋白尿相關(guān)性腎臟疾病發(fā)展進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。目前對足細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)的研究主要集中在①裂孔隔膜復(fù)合體(SDs)區(qū),包括:nephrin、podocin、CD2AP、ZO-1；②頂端膜蛋白區(qū):Podocalyxin、GLEPP-1；③基底膜相接觸的基底蛋白區(qū):α3β1整合素、Dystroglycan；④足細(xì)胞骨架蛋白:synaptopodin、α-actinin-4、F-actin等。這些對足

3、細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)的認(rèn)識從某種程度上為蛋白尿發(fā)生的分子機制提供了依據(jù)。但是對于蛋白尿發(fā)生的足細(xì)胞損傷及對其治療有效的分子水平的研究,目前仍無突破性的進(jìn)展。
　　 最新研究發(fā)現(xiàn):足細(xì)胞β3整合素活化、活動增強可導(dǎo)致足突融合和蛋白尿。尿激酶受體(urokinase recepter,uPAR)是β3整合素共受體,其細(xì)胞膜內(nèi)段很短,大部分結(jié)構(gòu)位于細(xì)胞表面與整合素及細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。正常情況下,分化成熟的足細(xì)胞處于相對靜止?fàn)顟B(tài),不具有分裂增殖的

4、能力,其表達(dá)多種足細(xì)胞特有的分子標(biāo)志物,通過β1整合素粘附于基底膜；而經(jīng)uPAR途徑的β3整合素活化可直接導(dǎo)致足細(xì)胞活動力增強及蛋白尿發(fā)生。Peter Mundel等教授認(rèn)為(KidInt,2009)蛋白尿發(fā)生涉及到足細(xì)胞上一系列酶的分解合成等信號變化,后者最終影響到足細(xì)胞的活動及骨架的改變。
　　 環(huán)孢素A(Cyclosporin A,CsA)被廣泛應(yīng)用于器官移植和免疫性疾病中,是具有里程碑意義的免疫抑制劑。目前,環(huán)孢素A已逐

5、漸應(yīng)用于各種腎小球疾病,并取得了很好的療效,尤其是環(huán)孢素A能夠有效地降低各種難治性腎病綜合癥中的尿蛋白,然而,其作用機制的研究仍缺少突破性進(jìn)展。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為,環(huán)孢素A主要通過抑制免疫(作用于T細(xì)胞)發(fā)揮抗蛋白尿效應(yīng),而目前最新研究發(fā)現(xiàn):壞孢素A降蛋白尿的作用靶點之一是足細(xì)胞,這解釋了“為什么在非免疫性。腎臟疾病中環(huán)孢素A仍然能有效降低尿蛋白?”。但是對于環(huán)孢素A在減少蛋白尿發(fā)生及足細(xì)胞損傷過程中,究竟扮演著怎樣一個角色仍不清楚。本研究通

6、過建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)小鼠蛋白尿模型和經(jīng)典的5/6腎切除大鼠模型兩個非免疫性蛋白尿模型以及體外脂多糖足細(xì)胞損傷模型,觀察環(huán)孢素A對于非免疫因素?fù)p傷引起的蛋白尿的影響及環(huán)孢素A對于足細(xì)胞p3整合素表達(dá)、活化及足細(xì)胞遷移力的影響,探討了環(huán)孢素A對于足細(xì)胞活動力改變的影響及其降低蛋白尿、穩(wěn)定足細(xì)胞進(jìn)而緩解難治性腎臟疾病中的非免疫性作用,以期闡明環(huán)孢素A降蛋白尿的作用機制。
　　 研究方法

7、>　　 一、建立非免疫性蛋白尿模型(脂多糖誘導(dǎo)小鼠蛋白尿模型和5/6腎切除大鼠模型),觀察環(huán)孢素A對蛋白尿的影響
　　 (一)脂多糖誘導(dǎo)小鼠蛋白尿模型制作:15只C57BL/6雄性小鼠隨機分為正常對照組(Con)、LPS處理組(LPS)、LPS與CsA共同處理組(LPS+CsA),每組5只,CsA溶入二甲基亞砜(DMSO)-20℃避光保存,LPS溶入生理鹽水4℃保存。LPS組腹腔注射LPS 200ug,并于第二天給予DMSO+

8、生理鹽水灌胃,LPS+CsA 組腹腔注射LPS 200ug,并于第二天給予CsA 25mg.kg-1+DMSO+生理鹽水灌胃,Con組給予等量生理鹽水腹腔注射及DMSO+生理鹽水灌胃。第三天處死動物。
　　 (二)5/6腎切除大鼠模型的制作:24只SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)對照組(Sham)、5/6腎切除組(NTX)、5/6腎切除+低劑量CsA干預(yù)組(NTX+CsA1)、5/6腎切除+高劑量CsA干預(yù)組(NTX+CsA2)。NT

9、X+CsA1組行5/6腎切除手術(shù),一周后每日給予CsA 1mg·kg-1灌胃,NTX+CsA2組行5/6腎切除手術(shù),一周后每日給予CsA5mg.kg-1 灌胃,NTX組行5/6腎切除手術(shù),一周后每日給予等量DMSO灌胃,Sham組行假手術(shù),一周后每日給予等量DMSO灌胃。
　　 (三)時間點設(shè)置及24小時尿蛋白檢測和腎組織觀察:脂多糖誘導(dǎo)小鼠蛋白尿模型于第2天留取24h尿液檢測蛋白濃度及尿肌酐濃度后處死并留取腎組織,5/6腎切除

10、大鼠模型分別于2周、4周、8周、12周留取24小時尿液檢測尿蛋白量后處死并耿腎組織。
　　 (四)脂多糖誘導(dǎo)小鼠蛋白尿模型中腎組織切片激光共聚焦觀察synaptopodin、活化p3整合素表達(dá)。
　　 二、足細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定及實驗分組
　　 (一)足細(xì)胞培養(yǎng):條件永生性小鼠足細(xì)胞由Baylor醫(yī)學(xué)院Danesh教授惠贈。首先在5％C02,33℃培養(yǎng)箱環(huán)境,用含20.100U·mL-1 IFN-γ的RPMI 1640

11、和10％FBS放入Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中共孵育,使其獲得增殖能力。然后轉(zhuǎn)入5％CO2,37℃培養(yǎng)箱,用不含IFN-γ的DMEM加10％FBS共孵育,經(jīng)10-14天的培養(yǎng)誘導(dǎo),足細(xì)胞進(jìn)入分化階段并最終分化成熟。
　　 (二)足細(xì)胞鑒定及形態(tài)學(xué)觀察:分別對33℃含IFN-γ培養(yǎng)及37℃不含IFN-γ培養(yǎng)10-14天分化成熟后的足細(xì)胞在相差顯微鏡下直接拍片,觀察其形態(tài)學(xué)差異；表達(dá)足細(xì)胞骨架蛋白synaptopodin的細(xì)胞為分化成熟的

12、足細(xì)胞,未分化的足細(xì)胞不表達(dá)synaptopodin蛋白。
　　 (三)按以下分組干預(yù)處理足細(xì)胞:
　　 ①正常對照組(Con):不加任何干預(yù)因素分化成熟的足細(xì)胞；
　　 ②LPS組(LPS):50-mg-L-1脂多糖與成熟足細(xì)胞共同孵育24h:
　　 ③CsA處理組(LPS+CsA):用50·mg.L-1脂多糖及0.5mg.T-1環(huán)孢素 A 共同干預(yù)24h；
　　 三、總β3整合素及其活化以及u

13、PAR的表達(dá)
　　 分別用免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)及定量PCR檢測β3整合素合成、活化及uPAR表達(dá)的變化。
　　 四、足細(xì)胞活動力檢測
　　 (一)轉(zhuǎn)板遷移測定法(Transwell migration assay):使用龍膽紫染色后,在倒置顯微鏡下攝片,觀察正常對照組、LPS處理組及LPS與CsA共同干預(yù)組足細(xì)胞遷移的變化。
　　 (二)刮除法(Wound healing assay):在Ⅰ型膠原包被的六

14、孔板爬片上培養(yǎng)細(xì)胞后,刮除細(xì)胞后給予不同的處理,觀察正常對照組、LPS處理組及LPS與CsA共同干預(yù)組足細(xì)胞損傷修復(fù)的變化情況。
　　 五、統(tǒng)計學(xué)處理計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法,方差齊性用LSD法進(jìn)行組間多重比較,方差不齊用Dunnett’s T3法進(jìn)行組間多重比較。P<0.05被定為有統(tǒng)計學(xué)差異。