中藥榮肝合劑對刀豆蛋白A介導(dǎo)的免疫性肝損傷降酶效應(yīng)的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 1.理論研究，探討清利活血健脾法與慢性乙型肝炎(CHB)的關(guān)系，為CHB的治療提供立法依據(jù)，為榮肝合劑提供組方基礎(chǔ)。
　　 2.研究思路探討，澄清“保肝降酶”治療過程中的一些概念，明確其內(nèi)涵，使中醫(yī)藥對CHB的治療更為全面客觀。
　　 3.實(shí)驗(yàn)研究，探討榮肝合劑對刀豆蛋白A(ConA)介導(dǎo)的急、慢性免疫性肝損傷小鼠的降酶效應(yīng)及其機(jī)制。
　　 4.臨床病例觀察，研究中藥榮肝合劑對CHB患者生存

2、質(zhì)量的影響。
　　 方法：
　　 1.在回顧和總結(jié)的基礎(chǔ)上，分析清利活血健脾法與CHB的關(guān)系，并與榮肝合劑相對應(yīng)，分析其組方依據(jù)。
　　 2.解析“保肝降酶”的內(nèi)涵，分析中醫(yī)藥保肝降酶治療CHB中存在的問題，探討其應(yīng)對措施。
　　 3.(1)急性肝損傷實(shí)驗(yàn)：HBV轉(zhuǎn)基因小鼠60只，隨機(jī)分為6組(模型組、正常組、榮肝合劑組、茵陳蒿湯組、茵陳組、聯(lián)苯雙酯組)，每組10只，采用ConA尾靜脈注射制作急性免疫性肝

3、損傷模型。造模后8h，處死動物取血或組織標(biāo)本檢測ALT、AST、TBiL；觀察病理組織學(xué)變化(HE染色)；HBV DNA、HBsAg;肝組織MDA及SOD水平；肝組織內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群情況變化(CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)；細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Fas、FasL、Bax、bcl—2)；肝組織中TNF—α、INF—γ、IL—4、IL—10等細(xì)胞因子的變化。
　　 (2)慢性肝損傷實(shí)驗(yàn)：HBV轉(zhuǎn)基因小鼠69只，隨機(jī)分為正常組10

4、只(尾靜脈注射PBS0.3ml)和ConA造模組59只，采用CortA6μg/g劑量尾靜脈注射制作慢性免疫性肝損傷模型。各組小鼠每日灌胃給予相應(yīng)藥物，正常組與模型組給予生理鹽水灌胃，共給藥28天。末次灌胃給藥后24h處死動物，取血或組織標(biāo)本檢測指標(biāo)(指標(biāo)同急性肝損傷實(shí)驗(yàn))。
　　 4.采用隨機(jī)對照研究。區(qū)組隨機(jī)，以榮肝合劑為治療藥物，與西藥口服抗病毒藥核苷(酸)類似物(NUCs)為對照，治療期為6個(gè)月，以3個(gè)月為一訪視點(diǎn)，考核患

5、者血清ALT、AST、HBV DNA水平變化，結(jié)合普適性量表SF—36及慢性肝病問卷(CLDQ)觀察榮肝合劑對于CHB患者生活質(zhì)量的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.CHB屬本虛標(biāo)實(shí)之證，濕熱、血瘀為標(biāo)，脾虛為本?；蛞姼斡?，久則及腎。
　　 2.CHB的保肝降酶未真正做到降低酶學(xué)指標(biāo)與肝組織學(xué)改善并重，未結(jié)合抗病毒、提高免疫力、防止纖維化的治療、少有關(guān)注患者生存質(zhì)量。
　　 3.(1)急性肝損傷實(shí)驗(yàn)：①AL

6、T、AST、TBiL情況：與正常組比較，模型組小鼠血清ALT、AST、TBiL均顯著升高(P<0.01)。榮肝合劑、聯(lián)苯雙酯均可顯著降低血清ALT、AST(P<0.01)，榮肝合劑可降低TBiL(P<0.01)。②病理組織學(xué)變化：與模型組比較，榮肝合劑組肝細(xì)胞變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤程度較輕，顯示其對肝組織的病理損傷有較好的改善作用(P<0.05)；而聯(lián)苯雙酯組、茵陳組與模型組的病損程度相似。③HBsAg、HBV DNA變化：榮肝合劑組H

7、BVDNA與茵陳組比較有顯著性差異(P<0.05)，其余指標(biāo)各組比較無顯著性差異。④MDA、SOD變化：與正常組相比較，模型組肝組織中SOD水平明顯低于正常組，MDA水平則明顯高于正常組(P<0.05)。榮肝合劑組可明顯提高肝組織中SOD水平，且與各干預(yù)組比較均有顯著性差異(P<0.01)。榮肝合劑、茵陳湯可降低肝組織中MDA水平(P<0.05)。⑤淋巴細(xì)胞亞群變化：CD4+CD8—T淋巴細(xì)胞所占比例，各藥物干預(yù)組與模型組比較均有升高，

8、以榮肝合劑最著，比較有顯著性差異(P<0.05)。CD4—CD8+T細(xì)胞所占比例，榮肝合劑組與模型組、聯(lián)苯雙酯組比較有顯著性差異(P<0.05)。CD4+/CD8+T細(xì)胞比例變化，與模型組相比，各中藥組均可見較大幅度升高，榮肝合劑組與茵陳蒿湯組比較有顯著性差異(P<0.05)。⑥Fas、FasL、Bax、bcl—2的變化：正常組中，F(xiàn)asL和Bax沒有表達(dá)，模型組Fas和bcl—2的表達(dá)水平與正常組比較，均有顯著差異(P<0.05)。與

9、模型組比較，榮肝合劑組Fas、FasL，、Bax、bcl—2、bcl—2/Bax比值等差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。⑦TNF—α、INF—γ、IL—4、IL—10的表達(dá)：模型組TNF—α、IFN—γ水平明顯高于正常組，而IL—4，IL—10水平明顯低于正常組(P<0.05)。榮肝合劑組TNF—α、INF—γ、IL—4、IL—10均較模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 (2)慢性肝損傷實(shí)驗(yàn)：①ALT、AST、TBiL情

10、況：與正常組比較，模型組小鼠血清ALT、AST、TBiL均顯著升高(P<0.01)。榮肝合劑、聯(lián)苯雙酯均可顯著降低血清ALT、AST及TBiL(P<0.01)。②病理組織學(xué)變化：榮肝合劑組、茵陳蒿湯組與模型組比較，在減輕肝細(xì)胞壞死、減少變性、減輕炎細(xì)胞浸潤以及減輕肝纖維化方面有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，榮肝合劑的作用優(yōu)于茵陳蒿湯(P<0.05)。③HBsAg、HBV DNA變化：榮肝合劑組HBV DNA水平與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)；H

11、BsAg方面，榮肝合劑組與其余各組比較均有顯著性差異(P<0.05)。④MDA、SOD變化：模型組肝組織中SOD含量明顯低于正常對照組，MDA水平明顯高于正常對照組，并有顯著性差異(P<0.01)。榮肝合劑組MDA、SOD均較模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，較其余組比較部分有顯著差異(P<0.05)。⑤肝組織中淋巴細(xì)胞亞群變化：CD4+CD8—T淋巴細(xì)胞，各藥物干預(yù)組與模型組比較，均有升高(P<0.05)；榮肝合劑與茵陳、茵陳蒿湯、聯(lián)苯雙酯比較，均

12、有顯著性差異(P<0.05)；CD4—CD8+T細(xì)胞，榮肝合劑組、聯(lián)苯雙酯組與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)；CD4+/CD8+T細(xì)胞比例變化，與模型組相比，各中藥組均可見較大幅升高，榮肝合劑組與茵陳蒿湯組、聯(lián)苯雙酯組比較有顯著性差異(P<0.05)。⑥.Fas、FasL、Bax、bcl—2的變化：正常組中，F(xiàn)asL和Bax沒有表達(dá)，模型組Fas和bcl—2的表達(dá)與正常組比較，均有顯著差異(P<0.05)。榮肝合劑組Fas、F

13、asL，、Bax、bcl—2、bcl—2/Bax比值均較模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，較其余組比較部分指標(biāo)有顯著差異(P<0.05)。⑦TNF—α、INF—γ、IL—4、IL—10的表達(dá)：模型組TNF—α、IFN—γ水平明顯高于正常組，而IL—4、IL—10水平明顯低于正常組(P<0.05)。TNF—α，榮肝合劑、茵陳組與模型組比較，均有顯著性差異(P<0.05)。IFN—γ，各藥物干預(yù)組與模型比較，均有顯著性差異(P<0.01)，榮肝合劑組與茵

14、陳組、聯(lián)苯雙酯組比較，均有顯著性差異(P<0.05)。IL—4，各藥物干預(yù)組與模型比較，均有顯著性差異(P<0.05)。IL—10，榮肝合劑、茵陳組與模型組比較，均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 4.治療3個(gè)月，兩組患者的ALT、AST的復(fù)常率均在80％以上，組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。榮肝合劑與NUCs對HBV DNA均有降低作用，但NUCs則明顯優(yōu)于榮肝合劑(P<0.05)。治療6個(gè)月后，兩組患者的ALT、A

15、ST水平均已降至正常值上限以下，組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)：HBV DNA方面，榮肝合劑和NUCs對HBV均持續(xù)發(fā)揮抑制作用(P<0.05)，但NUCs的HBV DNA陰轉(zhuǎn)率明顯高于榮肝合劑(P<0.05)。生活質(zhì)量改善方面：①治療3個(gè)月，榮肝合劑組患者生活質(zhì)量各個(gè)維度均有改善：而服用NUCs在生理職能、情感職能維度無明顯改善；組間比較顯示，榮肝合劑三個(gè)月治療后，患者的生理機(jī)能、生理職能、精力、生理內(nèi)容綜合測量、心理內(nèi)容綜合測

16、量、SF—36總分、CLDQ各維度均較NUCs有明顯的改觀(P<0.05)。②治療6個(gè)月：榮肝合劑對于患者生活質(zhì)量的改善持續(xù)起效，較基線與治療3月均有明顯好轉(zhuǎn)(P<0.05)；NUCs對CHB患者生活質(zhì)量亦有改善，但與基線比較，生理職能、情感職能和軀體疼痛維度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；較治療3月，軀體疼痛、社會功能、一般健康狀況及情感職能、生理內(nèi)容綜合測量維度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；組間比較顯示，榮肝合劑與NUCs對患者生存質(zhì)量的影響，除腹部

17、癥狀維度外，榮肝合劑均優(yōu)于NUCs(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.CHB治則當(dāng)以清熱利濕、活血化瘀、健脾扶正為大法，榮肝合劑立法與此一致，與慢性乙型肝炎病機(jī)相契合。
　　 2.CHB的保肝降酶治療要真正做到對肝臟組織學(xué)的改善與降低酶學(xué)指標(biāo)并重，并應(yīng)該結(jié)合抗病毒、提高免疫力、防止纖維化發(fā)生、提高患者生存質(zhì)量，并要加強(qiáng)臨床研究。
　　 3.通過本研究的進(jìn)行，可得出以下結(jié)論：①榮肝合劑的保肝降酶作用

18、不僅是對于外周血中酶的水平的降低，同時(shí)有伴有病理組織學(xué)的改善：減輕細(xì)胞炎癥、壞死及炎細(xì)胞浸潤、甚至逆轉(zhuǎn)纖維化的作用。②中醫(yī)藥復(fù)方榮肝合劑的保肝降酶作用要明顯優(yōu)于單味中藥(茵陳湯)和聯(lián)苯雙酯，清利活血健脾的治則對于乙肝的干預(yù)是有效的。③中醫(yī)藥保肝降酶作用起效的病理機(jī)制是多方面的：可減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高淋巴細(xì)胞亞群功能，減少炎癥因子的刺激、抑制肝細(xì)胞的凋亡。
　　 4.中藥榮肝合劑可使CHB患者的ALT、AST復(fù)常并降低H