胃癌的預后因素分析及mTOR抑制劑RAD001對胃癌細胞的作用機理研究.pdf

1、胃癌是嚴重危害人民健康的疾病。在全球范圍內(nèi)，胃癌發(fā)病率占所有惡性腫瘤的第四位，死亡率占第二位，每年約有100萬的新發(fā)患者。其中，60％的新發(fā)病例在亞洲。胃癌是目前中國的第三大常見腫瘤，根據(jù)2005年的資料，中國胃癌發(fā)病率在男性中達37.1/10萬，女性中為17.4/10萬。每年新發(fā)胃癌患者達40萬人，死亡人數(shù)達30萬人。手術是胃癌治療的主要方法，但療效仍徘徊不前，總體5年生存率僅30％左右。 影響胃癌預后的因素一直是臨床關注的熱

2、點問題，但各家報道不一。本論文中，我們首次通過906例大樣本資料，對胃癌D2術后患者的預后因素進行分析，探討胃癌臨床病理因素在預后的意義，以更進一步指導臨床治療。 同時，隨著分子生物學的不斷發(fā)展，預測胃癌預后的分子指標也已成為腫瘤研究的主要方向。近年來，表皮生長因子受體EGFR(epidermal growth factor receptor)，血管內(nèi)皮生長因子受體VEGF(vascular endothelial growth

3、 factor)等在胃癌預后方面的意義已給予很大關注。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammalian target of rapamycin)信號通路是當前腫瘤治療的新熱點，它的調(diào)控異常與腫瘤發(fā)生密切相關。在肝癌、乳腺癌、膽管癌中已經(jīng)證明，mTOR的活化形式磷酸化的mTOR(p—mTOR)高表達與預后呈負相關，是腫瘤治療的新靶點，但p—mTOR與胃癌預后的關系鮮見報道。 本論文中，我們進一步研究了胃癌組織中p—mTOR的表達

4、意義，分析它與胃癌預后的關系，并通過研究mTOR抑制劑依維莫司(RAD001)及聯(lián)合化療對胃癌細胞的作用機理，來探討mTOR作為胃癌潛在治療靶點的可行性。 第1部分906例胃癌根治術后預后多因素分析 目的：影響胃癌預后的因素很多，文獻報道差異較大。本研究根據(jù)淋巴結轉移數(shù)目的不同，在新的角度分析胃癌患者的預后，以加深對胃痛生物學行為的認識。 方法：回顧性分析中山大學腫瘤醫(yī)院1990年1月至2002年12月間接受D2

5、根治術的胃癌患者906例。根據(jù)淋巴結檢取個數(shù)不同分為兩組：第一組，淋巴結個數(shù)≤15，729例；第二組，淋巴結個數(shù)>15，177例。淋巴結轉移率分組：N ratio0，0％；N ratio1，1％—9％；N ratio2，10％—25％；N ratio3，>25％. 結果：兩組的5年生存率分別為49.9％和53.1％。單因素分析表明，兩組資料中腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移個數(shù)、淋巴結轉移率均與生存相關；但多因素分析顯示僅腫瘤浸潤深度和

6、淋巴結轉移率是影響患者術后生存的獨立因素。進一步分析顯示，在淋巴結檢取個數(shù)不同時，相同的淋巴結轉移率預后沒有統(tǒng)計學差異。 結論：腫瘤浸潤深度和淋巴結轉移率是影響患者D2術后的獨立影響因素。淋巴結轉移率是一個比淋巴結轉移個數(shù)更好的指標，在淋巴結檢取個數(shù)不足時，它仍然能夠判斷患者預后。 第2部分 p—mTOR在181例胃癌中的表達與預后的關系 目的：mTOR在多種腫瘤組織中均有表達，但其與胃癌關系的研究國內(nèi)尚無報道。

7、本章旨在檢測中國人胃癌組織中mTOR的活化形式p—mTOR的表達，并探討其與胃癌浸潤轉移及預后的關系。 方法：采用免疫組化方法檢測181例胃癌組織中p—mTOR蛋白的表達情況，并結合患者的臨床病理資料分析其與胃癌浸潤轉移相關性，通過COX模型多因素分析與胃癌患者預后的關系。 結果：所檢測的181例胃癌標本中p—mTOR蛋白表達陽性93例，陽性表達率為51.4％，p—mTOR陽性表達與胃癌的淋巴結轉移及臨床分期密切相關；而

8、與年齡，性別，腫瘤大小，病理T分期等臨床病理特征無顯著性相關(p>0.05)。p—mTOR陽性的病人的總生存率與無病生存率明顯比p—mTOR陰性的病人短(DFS，p=0.006and OS，p=0.011，respectively)。多因素分析中，p—mTOR的表達與預后呈相關趨勢。 結論：p—mTOR蛋白在胃癌組織中的陽性表達與胃癌的淋巴結轉移、臨床分期、腫瘤進展密切相關，可能成為預測胃癌轉移的新分子標志物和治療靶點。

9、 第3部分 RAD001聯(lián)合化療對胃癌細胞的作用及機理 目的：探索RAD001單藥以及與胃癌常用化療藥物ADM、5-FU、TAXOL、DDP聯(lián)合應用是否對胃癌AGS、BGC823、MKN28細胞有抑制作用并探討其機制。 方法：將RAD001單藥以及其分別與化療藥物ADM、5-FU、TAXOL、DDP藥物聯(lián)合作用于人胃癌AGS、BGC823、MKN28細胞，用MTT法檢測RAD001單藥及聯(lián)合用藥對胃癌細胞的抗增殖作用；用

10、流式細胞學(PI染色)檢測RAD001單藥對胃癌細胞凋亡/周期阻滯的影響；應用Western—blot分析P13K/Akt/mTOR直接底物蛋白p70s6k、p—p70s6k以及凋亡/周期相關蛋白P53、Bcl—2、C—myc、CyclinD1表達情況。 結果：RAD001單藥作用于人胃癌AGS、BGC823、MKN28細胞48小時后，測得IC50值分別為23.1μmol/L、21.7μmol/L、13.8μmol/L，提示RA

11、D001單藥對胃癌細胞均有抗增殖活性。RAD001單藥作用于AGS、BGC823、MKN28細胞48小時，流式細胞儀顯示胃癌細胞主要被阻滯在G1期，凋亡率隨藥物濃度而升高。Western—blot分析表明，mTOR底物p70s6k、p—p70s6k明顯下降，周期相關蛋白C—myc及CyclinD1表達均下降，凋亡相關蛋白P53表達增加、Bcl—2表達下降，證實了RAD001是通過改變下游p70S6K磷酸化水平而起作用，通過降低C—myc

12、及CyclinD1的表達而使細胞通過G1-S期的檢查點下降，將細胞阻滯在G1期，并可能通過抑制凋亡抑制蛋白Bcl—2，促進促凋亡蛋白P53表達而誘導胃癌細胞的凋亡。RAD001單藥分別與化療藥物ADM、5-FU、TAXOL、DDP以固定濃度混合共同作用于AGS、BGC823、MKN28細胞，結果采用金正均法顯示：RAD+ADM聯(lián)合呈現(xiàn)協(xié)同作用，RAD+5FU、RAD+DDP聯(lián)合呈現(xiàn)拮抗作用，RAD+Taxol聯(lián)合呈現(xiàn)單純相加作用。流式細

13、胞儀顯示凋亡率較各單藥組升高。Western—blot分析表明，mTOR底物p70s6k、p—p70s6k較各單藥組下降，與單獨用藥相比，凋亡相關蛋白P53表達增加、Bcl—2表達下降，這表明，RAD001作用于AGS、BGC823、MKN28細胞48小時后，與對照組蛋白表達情況相比，p70s6k、p—p70s6k在實驗組表達明顯受到抑制，提示RAD+ADM的協(xié)同作用是通過阻斷靶點mTOR，使P13K/AKT/mTOR信號路的下游受到抑

14、制，并可導致細胞凋亡，導致腫瘤細胞生長受到抑制。 結論：RAD001單藥及化療藥物ADM、5-FU、TAXOL、DDP藥物對人胃癌AGS、BGC823、MKN28細胞均有良好抗增殖作用；RAD+ADM聯(lián)合呈現(xiàn)協(xié)同作用，RAD+5FU、RAD+DDP聯(lián)合呈現(xiàn)拮抗作用，RAD+Taxol聯(lián)合呈現(xiàn)單純相加作用；這些作用是通過改變下游p70S6K磷酸化水平，使細胞停滯在G1期，并可能通過抑制凋亡抑制蛋白Bcl—2，促進促凋亡蛋白P53表