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文檔簡(jiǎn)介
1、全身麻醉作用機(jī)理研究已有160多年的歷史,特別是中樞作用部位,至今仍然是國(guó)內(nèi)外麻醉學(xué)界十分關(guān)注而又懸而未決的研究課題。
研究目的:本研究目的旨在應(yīng)用分子生物學(xué)、免疫組化及免疫熒光雙標(biāo)等多種先進(jìn)的神經(jīng)科學(xué)技術(shù),以GAD67-GFP基因敲入小鼠為研究對(duì)象,系統(tǒng)觀察在吸入麻醉藥七氟烷的作用下,腦內(nèi)GABA神經(jīng)元被激活的部位及其GABAA受體參與的部位及細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。為進(jìn)一步闡明全身麻醉中樞作用機(jī)理提供新的證據(jù)。
研究方法:<
2、br> 第一部分:成年雄性GAD67-GFP基因敲入小鼠隨機(jī)分為3組:C組(CGroup)空白對(duì)照組;S1組(S1Group):淺麻醉狀態(tài)(Incompleteanesthesiastate)組,即小鼠反正反射消失但不超過(guò)30秒;S2組(S2Group):深麻醉狀態(tài)(Completeanesthesiastate)組,即反正反射完全消失30s以上。各組GAD67-GFP基因敲入小鼠達(dá)到預(yù)設(shè)麻醉狀態(tài)后,取腦制取腦薄片(片厚30μm),分
3、別進(jìn)行Fos免疫組化染色、GABA神經(jīng)元和Fos蛋白的免疫熒光雙標(biāo)染色,在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù);并快速取出GAD67-GFP基因敲入小鼠海馬和丘腦,制備RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,設(shè)計(jì)合成c-Fos基因mRNA序列相應(yīng)的特異性引物,實(shí)施熒光定量PCR檢測(cè),所有PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
第二部分:c57野生小鼠實(shí)驗(yàn)分組同第一部分,設(shè)計(jì)合成GABAA受體α4亞單位特異性引物,實(shí)施GABAA受體α4亞單位熒光定量P
4、CR檢測(cè),同時(shí)進(jìn)行GABAA受體與Fos免疫熒光雙標(biāo)染色,在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)
研究結(jié)果:
第一部分:七氟烷對(duì)GAD67-GFP基因敲入小鼠腦內(nèi)GABA神經(jīng)元激活作用的研究
1.對(duì)GAD67-GFP基因敲入小鼠腦內(nèi)Fos蛋白表達(dá)的影響結(jié)果表明:吸入麻醉藥七氟烷能誘導(dǎo)GAD67-GFP基因敲入小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)(Cg1,Cg2)、海馬(CA1,DG)、下丘腦背內(nèi)側(cè)核(DM)、中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(PAG)
5、、丘腦室旁核(PV)、外側(cè)隔核(LS)等部位Fos的表達(dá),與C組相比明顯增多(P<0.05),隨麻醉深度增加S2組比S1組Fos蛋白表達(dá)增多(P<0.05)。還發(fā)現(xiàn)在杏仁核中間部(MeA)、E-W核(E-Wnucleus)、弓狀核(Arc)和下丘腦室旁核腹側(cè)核(PaV)等部位Fos表達(dá)僅出現(xiàn)在S2組。
2.對(duì)GAD67-GFP基因敲入小鼠海馬和丘腦FosmRNA的影響熒光定量PCR結(jié)果表明c-fosmRNA在海馬和丘腦部位S1
6、和S2組表達(dá)與對(duì)照組相比明顯上調(diào)(P<0.01),并且S2組上調(diào)更多與S1組相比有顯著差異(P<0.01)。
3.對(duì)GAD67-GFP基因敲入小鼠腦內(nèi)GABA和Fos共存表達(dá)的影響免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明:在外側(cè)隔核(LS)幾乎所有的Fos都存在于GABA神經(jīng)元內(nèi),并且在S2組中共存于GABA神經(jīng)元內(nèi)的Fos與S1組相比明顯增多。在海馬(CA1,DG),下丘腦背內(nèi)側(cè)核(DM),皮質(zhì)(Cg1,Cg2)和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(PAG),
7、僅有少部分的Fos存在于GABA神經(jīng)元內(nèi),大部分Fos表達(dá)于GABA神經(jīng)元之外。PV有較多的Fos表達(dá),但并沒(méi)有GABA神經(jīng)元存在。而在PaV、MeA、Arc及E-W這幾個(gè)部位的S2組中也有Fos表達(dá),但是在這幾個(gè)神經(jīng)核團(tuán)中幾乎沒(méi)有Fos共存于GABA神經(jīng)元內(nèi)。
第二部分:七氟烷對(duì)野生c57小鼠腦內(nèi)GABAA受體作用的研究
1.對(duì)野生c57小鼠腦內(nèi)GABAA受體α4亞單位mRNA表達(dá)的影響.在小鼠腦干和丘腦部位GAB
8、AA受體α4亞單位mRNA表達(dá)S1和S2組與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.01),S2組與S1組相比顯著升高(P<0.01)。
2.對(duì)野生c57小鼠腦內(nèi)GABAA受體蛋白表達(dá)的影響免疫熒光結(jié)果表明:S1和S2組在腦干和丘腦內(nèi)GABAA受體蛋白與Fos蛋白共存表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增加,并且S2組與S1組相比明顯增加(P<0.05)。
研究結(jié)論:
1.吸入麻醉藥七氟烷能誘導(dǎo)Fos蛋白和c-fosmRNA在GAD6
9、7-GFP基因敲入小鼠腦內(nèi)多個(gè)核團(tuán)神經(jīng)元呈陽(yáng)性表達(dá),且表達(dá)的數(shù)量隨七氟烷麻醉深度增加而增多。
2.吸入麻醉藥七氟烷能誘導(dǎo)GAD67-GFP基因敲入小鼠腦內(nèi)相關(guān)核團(tuán)GABA神經(jīng)元和Fos存在明顯的共存現(xiàn)象,也具有部位差異及顯著的濃度相關(guān)關(guān)系。
3.吸入麻醉藥七氟烷能誘導(dǎo)野生c57小鼠腦干和丘腦GABAA受體與Fos共存表達(dá)且具有濃度相關(guān)性。
以上結(jié)論可證明吸入麻醉藥七氟烷能夠濃度相關(guān)性的激活小鼠腦內(nèi)不同部位的
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