副流感病毒5型CC-14株作為狂犬病重組疫苗載體的基礎研究.pdf

1、狂犬病是全球流行、危害嚴重的人獸共患病，由嗜神經(jīng)性的狂犬病病毒（rabies virus, RABV）感染所引起。自2007年以來，我國人狂犬病疫情持續(xù)下降，但每年仍有1000例左右，且流行區(qū)域有不斷擴大的趨勢，這對于動物免疫覆蓋率不高的我國大部分地區(qū)而言，形勢仍然相當嚴峻。
　　人在狂犬病的傳播中居于最后一個環(huán)節(jié)，幾乎所有人的狂犬病都是從動物傳播而來。因此，人狂犬病的根本控制需要從源頭入手，即控制流浪犬和野生動物狂犬病的傳播。流

2、浪動物和野生動物狂犬病唯一可行的控制方式是口服免疫?？诜呙缬袃深?，分別為減毒活疫苗和重組活載體疫苗，其中減毒活疫苗主要在歐洲使用，因存在一定的殘存毒力，不適用于流浪犬或與人群接觸較多的野生動物。目前，美國、加拿大和歐洲分別批準了以痘苗病毒和人5型腺病毒為載體表達狂犬病病毒糖蛋白的重組疫苗在不同野生動物種群中的應用或試驗研究，有效降低了動物狂犬病的發(fā)病率，取得了良好的免疫效果。但我國尚無類似疫苗上市，而從長遠發(fā)展來看，口服疫苗的研制和應

3、用才是我國流浪犬和野生動物狂犬病控制的必經(jīng)之路。
　　副流感病毒5型（Parainfluenza virus5, PIV5）系副黏病毒科（Paramyxov iridae），腮腺炎病毒屬（Rubulavirus），其基因組為單股負鏈RNA，該病毒于1956年自猴體內首次分離，故以往稱之為猴病毒5型（Simian virus5, SV5）。臨床上，該病毒可引起犬病發(fā)“犬窩咳”，除此之外，本實驗室于2013年在長春白城地區(qū)肉牛養(yǎng)殖場發(fā)

4、現(xiàn)該地區(qū)犢牛亦可感染該病毒（分離毒株為PV5-BC14株）而暴發(fā)呼吸道疾病。隨著負鏈RNA病毒的反向遺傳學技術的發(fā)展，PIV5因其感染方式直接、宿主范圍廣泛、基因組相對穩(wěn)定、在大多數(shù)細胞中可獲得高滴度的病毒等諸多優(yōu)點而備受關注，先后成為流感病毒、RABV等重要病原的重組疫苗載體，具有廣闊的應用空間和巨大的經(jīng)濟價值。
　　本研究嘗試以PIV5犬源疫苗株（CC-14株）為載體，建立其反向遺傳學操作系統(tǒng)，使之表達具有良好免疫原性的RAB

5、V BD06株糖蛋白，旨在研制一種免疫效果較好的新型狂犬病重組口服疫苗。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，PIV5牛源PV5-BC14株與犬源CC-14株同源性最高（基于NP基因編碼區(qū)序列）。而且近年來，牛感染狂犬病的情況在新疆、內蒙古、黑龍江等地常有發(fā)生，且多由狐貍、流浪犬咬傷引起。因此，以PIV5犬源疫苗株CC-14株作為載體的狂犬病重組疫苗的研究對于犬和?？袢〉念A防都有實際意義。
　　本研究的試驗過程及相應結果概述如下：
　　1.

6、PIV5 CC-14株全基因組測序及分析：根據(jù)GenBank中報道的SV5株全基因組序列設計14對引物，通過RT-PCR方法獲得了覆蓋全長的14個基因片段，并將這些片段分別克隆進pMD18-T載體中，以通用引物進行序列測定、拼接并分析。結果顯示，PIV5 CC-14株的全基因組大小為15246nt(基因庫登錄號為KP893891)，其與大多數(shù)PIV5毒株基因組結構的不同之處在于CC-14株沒有SH基因。以高度保守的1530bp NP基因

7、序列對現(xiàn)有PIV5毒株進行同源比對和系統(tǒng)發(fā)生分析，同源比對結果表明，PIV5 CC-14株與其他17株參考序列的核苷酸同源性為97.25％～99.80%，推導氨基酸同源性為98.62%～99.80%；系統(tǒng)發(fā)生分析表明，CC-14株和牛源PV5-BC14株同屬一個分支。
　　2. PIV5 CC-14株感染性克隆的構建：對PIV5 CC-14基因組全長進行酶切圖譜分析，根據(jù)酶切位點的分布，設計7對引物，分段進行RT-PCR擴增得到目

8、的基因片段，經(jīng)過一系列酶切、連接、亞克隆、克隆等過程，構建出基因組全長cDNA：pPIV5，該質粒中預設了外源基因的插入位點NotⅠ。為驗證該反向遺傳系統(tǒng)的完善性，將兩端含有PIV5轉錄復制元件的EGFP編碼區(qū)基因按照上述常規(guī)實驗方法插入pPIV5的NotⅠ位點，從而構建出pPIV5-EGFP；基于RABV強度株BD06的糖蛋白具有較好的免疫原性，將兩端含有PIV5轉錄復制元件的B D06糖蛋白（glycoprotein, G）編碼區(qū)基

9、因插入pPIV5的NotⅠ位點，從而構建出pPIV5-BD06-G。為提高病毒的拯救效率，在構建基因組全長cDNA時，在基因組cDNA上游引入T7啟動子，使基因組全長cDNA置于T7啟動子下游，另外，在基因組cDNA下游引入丁肝病毒核酶結構（HdvRz）。此外，按照上述常規(guī)試驗方法分別構建三個輔助質粒pcDNA3.1-NP、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L。上述試驗所得質粒分別經(jīng)酶切鑒定、序列測定、拼接和分析，最終確定所有質粒

10、序列準確無誤。
　　3. PIV5 CC-14株重組病毒的拯救：將驗證質粒pPIV5-EGFP，輔助質粒pcDNA3.1-NP、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L共轉染培養(yǎng)于6孔板中的BHK-T7細胞，待轉染48h后，將細胞轉移至細胞瓶中培養(yǎng)3-4天，觀察是否有熒光，目前本實驗仍在進行中。
　　4.重組病毒拯救輔助細胞系的構建（穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶的MDCK細胞系的構建）：鑒于PIV5 CC-14株在MDCK細

11、胞生長良好，因此我們嘗試采用MDCK細胞來構建一個穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶的MDCK細胞系，用于將感染性克隆包裝成病毒。首先，通過G418篩選確定MDCK細胞的G418最低致死濃度為1300μg/ml；其次，將表達T7 RNA聚合酶的質粒pcDNA3.1-T7質粒轉染正常MDCK細胞，次日施加1300μg/ml的G418壓力，此后，每隔兩天更換一次1300μg/ml的G418培養(yǎng)基，兩周后將生長出來的細胞采用有限稀釋挑取單克??；最后，

12、將挑取的單克隆細胞轉染驗證質粒pUC57-IRES-T7-EGFP以及其他方法驗證是否獲得該細胞系，此實驗仍在進行中。
　　5. PIV5 CC-14株檢測方法的建立：由于該病毒沒有細胞病變（CPE），我們分別用RT-PCR、間接免疫熒光試驗、血細胞吸附、血凝試驗這四種方法來檢測該病毒，研究表明，這些方法中血細胞吸附是一種非常便捷的方法。
　　總結：
　　1.本研究完成了PIV5 CC-14株全基因組測序(登錄號：KP

13、893891)及分析。
　　2.構建了 pcDNA3.1-NP, P, L三個輔助質粒以及 pPIV5, pPIV5-EGFP, pPIV5-BD06-G三個全長質粒。
　　3.建立了便捷的血細胞吸附的方法檢測PIV5 CC-14株。
　　4.穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶的MDCK細胞系的構建以及重組病毒的拯救實驗仍在進行中。
　　論文的創(chuàng)新點：
　　1.本課題是國內首次嘗試將PIV5病毒載體用于狂犬病重組疫