Ti m-3 抑制抗感染免疫的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　近些年來(lái)，各種病毒性疾病如流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、埃博拉病毒感染等的發(fā)病呈日益上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人們的生命健康，帶給家庭和社會(huì)沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，人和動(dòng)物約有60％的疾病是由病毒感染引起的，其中流感病毒流行性強(qiáng)、具周期性、有些可人獸共患，因此流感病毒極具危害性。在應(yīng)對(duì)流感等病毒感染中，宿主通過(guò)產(chǎn)生多種免疫效應(yīng)分子如干擾素和抗體等對(duì)抗感染，其中Ⅰ型干擾素（TypeⅠInterferon）作為固有免疫應(yīng)答

2、的重要效應(yīng)分子，在早期抗病毒免疫中占有尤為重要的作用。
　?、裥透蓴_素及其他免疫效應(yīng)分子在抗病毒免疫中具有重要作用，生理及病理情況下Ⅰ型干擾素的調(diào)控機(jī)制如何，能否從中尋找新的抗病毒治療策略等是本領(lǐng)域研究者普遍關(guān)注的課題。我們前期研究關(guān)注固有免疫調(diào)控機(jī)制的研究，基于芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)抑制性免疫檢查點(diǎn)分子T細(xì)胞免疫球蛋白及粘蛋白3（T-cell-Ig-muci n-3，Tim-3）負(fù)性調(diào)控巨噬細(xì)胞中Ⅰ型干擾素相關(guān)分子如RIG-I（retin

3、oic acid-i nducible gene I）、IFI44（Interferon inducible factor44）、ISG15（Interferon sti mulated gene15）等的表達(dá)?；诖耍琓im-3是否通過(guò)抑制Ⅰ型干擾素參與抗感染免疫的調(diào)控，其臨床意義如何成為我們重點(diǎn)關(guān)注的課題。
　　Tim-3是一最初發(fā)現(xiàn)于活化的T效應(yīng)細(xì)胞上的免疫細(xì)胞活性調(diào)控分子，按照結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)屬于Tim家族成員。Tim-3與其配體

4、半乳凝素9（Galectin-9，Gal-9）結(jié)合后能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或者通過(guò)其他機(jī)制抑制T效應(yīng)細(xì)胞（Th1/Th17/Tc1）的功能，維持T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。Ti m-3表達(dá)異常與多種免疫相關(guān)疾病如自身免疫病、腫瘤及病毒感染的關(guān)系越來(lái)越受到人們的重視，被認(rèn)為是繼CTLA-4、PD-1之后一種新的免疫治療靶點(diǎn)。
　　除了表達(dá)在活化的T細(xì)胞上外，Tim-3還表達(dá)在人和鼠的固有免疫細(xì)胞上。Tim-3信號(hào)對(duì)固有免疫反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制目前尚不十分清

5、楚，此方面研究近來(lái)引起人們的普遍關(guān)注。鑒于巨噬細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞在抗病毒感染中處于一線防御地位，在感染情況下Tim-3信號(hào)如何調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能，如何通過(guò)調(diào)控固有免疫反應(yīng)影響抗病毒感染的進(jìn)程是非常值得探討的課題。
　　我們實(shí)驗(yàn)室較早關(guān)注Tim-3信號(hào)對(duì)固有免疫的調(diào)控作用。已有研究顯示Tim-3在膿毒血癥（Sepsis）中的功能或表達(dá)異常與體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞的異?；罨嘘P(guān)，隨后證實(shí)Tim-3可以通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的NF-kB活化等機(jī)制

6、負(fù)性調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能，這提示Ti m-3信號(hào)對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫功能負(fù)性調(diào)控作用，但具體的分子機(jī)制尚需要進(jìn)一步探討。我們的研究提示Tim-3有可能是巨噬細(xì)胞潛在的調(diào)控靶點(diǎn)。
　　Tim-3分子胞內(nèi)段較短，不存在像其他負(fù)性免疫調(diào)控分子（如PD-1）一樣的抑制性基序，因此目前對(duì)于該分子發(fā)揮抑制作用的分子機(jī)制研究存在一定的困難。近年來(lái)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Kuchroo教授的課題組一直在關(guān)注Tim-3信號(hào)在T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用，他們發(fā)現(xiàn)Bat

7、3（HLA-B-associated transcript3）和CEACAM1（carcinoembryonic antigen celladhesion molecule1）參與了Tim-3信號(hào)對(duì)T細(xì)胞的負(fù)性調(diào)控過(guò)程，但該研究聚焦在T細(xì)胞。Ti m-3信號(hào)如何抑制固有免疫細(xì)胞、其胞內(nèi)的信號(hào)通路是迫切需要回答的課題。
　　基于我們前期的研究基礎(chǔ)，Tim-3信號(hào)是否通過(guò)抑制固有免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)體的抗感染免疫進(jìn)程，如果是，其分子機(jī)制如何

8、成為本論文要重點(diǎn)回答的課題。
　　目的：
　　1、以H1N1（PR8）病毒感染為模型，明確Tim-3信號(hào)對(duì)H1N1病毒感染的影響；
　　2、在H1N1病毒感染小鼠體內(nèi)以及在巨噬細(xì)胞中明確Tim-3信號(hào)對(duì)Ⅰ型干擾素及其相關(guān)分子的調(diào)控作用；
　　3、重點(diǎn)闡明Tim-3信號(hào)調(diào)控巨噬細(xì)胞Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的分子機(jī)制。
　　方法與結(jié)果：
　　1、Tim-3信號(hào)負(fù)性調(diào)控體內(nèi)外抗H1N1免疫反應(yīng)：
　　1.1

9、 Tim-3信號(hào)負(fù)性調(diào)控體內(nèi)抗H1N1免疫反應(yīng)，加重組織損傷。我們建立小鼠的早期H1N1感染模型，發(fā)現(xiàn)與野生型（WT）小鼠相比，Tim-3轉(zhuǎn)基因（Tim-3 TG）小鼠H1N1滴度升高，肺病理?yè)p傷加重；在感染H1N1的WT小鼠體內(nèi)注射可溶性Tim-3蛋白（soluble Tim-3,sTim-3）阻斷Tim-3信號(hào)后，小鼠H1N1滴度降低，肺病理?yè)p傷改善，表明Tim-3信號(hào)對(duì)體內(nèi)抗H1N1感染發(fā)揮抑制作用。
　　1.2 Tim-3

10、信號(hào)抑制重要的固有免疫細(xì)胞——巨噬細(xì)胞的抗H1N1病毒免疫反應(yīng)。我們用H1N1病毒感染巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞中Tim-3表達(dá)水平升高并伴隨高載量H1N1病毒；瞬轉(zhuǎn)Tim-3質(zhì)粒以過(guò)表達(dá)Tim-3，巨噬細(xì)胞病毒載量升高；阻斷Tim-3信號(hào)后巨噬細(xì)胞病毒載量下降。
　　2、體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Tim-3信號(hào)抑制Ⅰ型干擾素及其相關(guān)分子的表達(dá)：
　　為了初步探討Tim-3信號(hào)抑制抗H1N1感染免疫的機(jī)制，我們：
　　1）通過(guò)芯片數(shù)據(jù)

11、分析了Tim-3信號(hào)影響免疫功能的可能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Tim-3信號(hào)抑制巨噬細(xì)胞中Ⅰ型干擾素相關(guān)分子的表達(dá)；
　　2）在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，分析了干預(yù)Tim-3信號(hào)對(duì)H1N1感染小鼠體內(nèi)Ⅰ型干擾素及其相關(guān)分子表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tim-3信號(hào)抑制體內(nèi)Ⅰ型干擾素及其相關(guān)分子的表達(dá)；
　　3）在體外試驗(yàn)中，通過(guò)阻斷Tim-3信號(hào)，沉默以及過(guò)表達(dá)Tim-3的方法，并通過(guò)Q-PCR、Western blot、ELISA等技術(shù)驗(yàn)證了Tim-3信號(hào)對(duì)

12、Ⅰ型干擾素相關(guān)分子表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tim-3信號(hào)抑制巨噬細(xì)胞中Ⅰ型干擾素的表達(dá)，同時(shí)對(duì)RIG-I、IFI44、ISG15等分子發(fā)揮抑制作用。
　　3、Tim-3信號(hào)抑制Ⅰ型干擾素及其相關(guān)分子表達(dá)的分子機(jī)制探討
　　鑒于RIG-I在感應(yīng)H1N1病毒以及在調(diào)控Ⅰ型干擾素表達(dá)中的關(guān)鍵作用，本研究重點(diǎn)是“Tim-3信號(hào)通過(guò)調(diào)控RIG-I的表達(dá)及功能來(lái)調(diào)控Ⅰ型干擾素及相關(guān)分子的表達(dá)”，并對(duì)這一研究假設(shè)進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　3.1

13、 Tim-3通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子STAT1抑制RIG-I在巨噬細(xì)胞的表達(dá)。我們?cè)赥im-3沉默體系發(fā)現(xiàn)，敲低Tim-3后RIG-I的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而STAT1的抑制劑fludarabine顯著下調(diào)RIG-I的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平；我們還分析了RIG-I的啟動(dòng)子序列并將 RIG-I啟動(dòng)子區(qū)整合到 PGL3熒光素酶報(bào)告基因載體上，構(gòu)建了STAT1和Tim-3真核表達(dá)質(zhì)粒，在雙熒光素酶報(bào)告體系中發(fā)現(xiàn)STAT1會(huì)顯著提升RIG-I轉(zhuǎn)錄水平，而Tim-

14、3過(guò)表達(dá)抑制由STAT1所激活的RIG-I轉(zhuǎn)錄。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Tim-3抑制STAT1對(duì)RIG-I的轉(zhuǎn)錄激活。
　　3.2 Tim-3在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控RIG-I的泛素化。
　　泛素化修飾是調(diào)控RIG-I功能的一種重要方式，我們探討了Tim-3是否以及如何參與RIG-I泛素化的調(diào)控。
　　3.2.1 Tim-3與RIG-I之間存在相互作用和共定位。我們利用免疫共沉淀（Co-IP）的方法檢測(cè)，內(nèi)源和外源表達(dá)的Tim-3/R

15、IG-I之間都存在相互作用；共轉(zhuǎn)RIG-I/Tim-3熒光載體并在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)兩者之間存在共定位。
　　3.2.2Tim-3信號(hào)上調(diào)RIG-I K48連接的泛素化（RIG-I在蛋白酶體降解的標(biāo)記），下調(diào)K63連接的泛素化（RIG-I活化的標(biāo)記）。我們通過(guò)IP的方法檢測(cè)了在有無(wú)Tim-3表達(dá)的情況下RIG-I泛素化水平的變化，發(fā)現(xiàn)Tim-3過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)RIG-I K48連接的泛素化，并進(jìn)而促進(jìn)RIG-I的降解；Tim-

16、3過(guò)表達(dá)抑制RIG-IK63連接的泛素化。而Tim-3胞內(nèi)段缺失突變后，上述兩種調(diào)節(jié)泛素化的效應(yīng)消失。
　　3.2.3 Tim-3與A20共同參與RIG-I的泛素化調(diào)控。首先，我們進(jìn)一步通過(guò)Co-IP和Confocal的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Tim-3與A20、RIG-I這兩個(gè)分子之間同時(shí)存在相互作用和共定位；A20參與Tim-3對(duì)RIG-I K48和K63這兩種形式的泛素化調(diào)控，其作用結(jié)果是促進(jìn)RIG-I在蛋白酶體的降解，抑制RIG-I信號(hào)

17、的活化。
　　3.2.4 Tim-3通過(guò) A20/RIG-I/IRF-7(IRF-3)軸調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素表達(dá)。我們?cè)赥im-3信號(hào)阻斷體系，Tim-3基因沉默體系和 Tim-3過(guò)表達(dá)體系中發(fā)現(xiàn)，Tim-3與A20聯(lián)合，通過(guò)調(diào)控RIG-I K48/K63連接的泛素化來(lái)促進(jìn)RIG-I降解并抑制RIG-I的活化并進(jìn)而抑制IRF-3/7的磷酸化。提示存在Tim-3/A20-RIG-I-IRF-3/7-Ⅰ型干擾素調(diào)節(jié)軸。
　　結(jié)論：

18、r>　　本研究重點(diǎn)探討了Tim-3信號(hào)影響抗病毒免疫的分子機(jī)制，本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于：
　　1）Tim-3在病毒性感染中的研究中多關(guān)注T細(xì)胞，我們重點(diǎn)闡明了病毒感染過(guò)程中Tim-3抑制固有免疫功能的分子機(jī)制；
　　2）我們闡明了Tim-3對(duì)RIG-I這一關(guān)鍵病毒受體的負(fù)性調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了Tim-3/A20- RIG-I-IRF-3/7-Ⅰ型干擾素調(diào)節(jié)軸的存在，為進(jìn)一步了解這一分子的調(diào)控功能提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本研究