抗感染金屬植入物的設(shè)計制備及其抗感染效果研究.pdf

1、感染仍然是骨科植入物的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。植入體內(nèi)的金屬異物是導(dǎo)致此類感染發(fā)生的危險因素,所引發(fā)的一系列體內(nèi)反應(yīng)包括巨噬細(xì)胞功能的減弱,局部免疫系統(tǒng)的鈍化等都為病原體的增殖創(chuàng)造了便利的條件。此外,植入物表面吸附的蛋白還能促進(jìn)細(xì)菌黏附到植入物表面引發(fā)感染。過去我們大多關(guān)注對環(huán)境和個人污染的清除及圍手術(shù)期全身抗生素的應(yīng)用,而新的策略則是針對該類感染發(fā)病的特殊機制通過植入物表面修飾改性來降低感染的風(fēng)險。
　　全身用藥時,可能會因患處血液循環(huán)

2、受損和周圍瘢痕組織的影響導(dǎo)致病灶處的抗生素濃度無法達(dá)到有效水平,從而影響金屬材料植入后感染防治效果,還會帶來全身的毒副作用。研究證實,細(xì)菌一旦被隔離在無血運的骨組織中,抗生素的全身治療很難在局部達(dá)到滿意的藥物濃度。而且,一旦病原體附著于骨或其它生物材料表面,就會產(chǎn)生代謝和表型的改變,使病原體能夠?qū)股禺a(chǎn)生抵抗和逃脫免疫監(jiān)督,局部較低的抗生素濃度反而有可能會成為細(xì)菌耐藥性選擇的動力。為了改善骨感染的治療效果,抗生素的局部給藥方法得到研究

3、與開發(fā)。其中,抗生素緩釋系統(tǒng)以其具有的藥物持續(xù)性和可調(diào)控性釋放特點而受到青睞。
　　本項目組在前期低彈β鈦合金和藥物控釋研究的基礎(chǔ)上,對鈦合金表面進(jìn)行規(guī)則微形態(tài)改性,然后進(jìn)行多巴胺涂層修飾并以其為媒介將慶大霉素明膠微球緩釋系統(tǒng)成功構(gòu)建于鈦合金表面,通過前期的表面表征分析,藥物釋放實驗和體外抑菌實驗等證實該金屬表面抗生素緩釋系統(tǒng)具有微球結(jié)合牢固,藥物釋放持續(xù)可控,體外抑菌作用明顯等優(yōu)點。本研究主要在前期工作的基礎(chǔ)上繼續(xù)探索該金屬表面

4、抗感染緩釋系統(tǒng)的體內(nèi)外生物相容性及動物感染狀況下的材料植入對已發(fā)感染的控制效果。
　　目的
　　在前期低彈β鈦合金表面抗生素緩釋系統(tǒng)成功構(gòu)建的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過體外細(xì)胞實驗和熒光染色研究多巴胺涂層修飾對成骨細(xì)胞黏附的影響及其生物相容性,通過小鼠肌袋植入實驗觀察復(fù)合材料的體內(nèi)生物相容性,建立兔脛骨骨髓炎模型,并最后通過兔脛骨骨髓炎模型的體內(nèi)植入,研究鈦合金表面抗生素緩釋系統(tǒng)對于感染的控制作用,從而為抗感染金屬植入物的研制和開發(fā)

5、奠定理論和實驗基礎(chǔ)。
　　方法
　　1.鈦合金表面多巴胺修飾的細(xì)胞相容性檢查:為探索多聚多巴胺涂層的生物相容性,將家兔來源的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞接種于多聚多巴胺涂層修飾后的鈦合金表面,然后分別采用 MTT定量計算和激光共聚焦顯微鏡定性觀察的手段,分析材料表面細(xì)胞的粘附、增殖情況,并與未涂層材料作對比,觀察涂層修飾后材料生物相容性的變化。然后鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液,分別對活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行熒光染

6、色,觀察細(xì)胞生長存活情況。鈣黃綠素可顯示胞漿,PI顯示死細(xì)胞的細(xì)胞核。采用激光共聚焦顯微鏡對活細(xì)胞生長形態(tài)進(jìn)行觀察。胞漿結(jié)構(gòu)完整的綠色代表正常細(xì)胞,胞漿碎片狀結(jié)構(gòu)不完整、細(xì)胞核紅染的代表晚期凋亡細(xì)胞。
　　2.復(fù)合材料的體內(nèi)生物相容性檢測:將30只Balb/c小鼠隨機分為3組,A組植入復(fù)合抗感染材料,B組植入單純鈦合金材料,C組采取切開縫合處理。術(shù)后1、2、3、6周取材,采集外周血用流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞亞群分類CD4和CD8的

7、百分比變化情況并進(jìn)行組織學(xué)觀察,評估復(fù)合抗感染材料在體內(nèi)的生物相容性。
　　3.骨科金屬植入物感染動物模型構(gòu)建方法:(1)將健康家兔48只隨機分為5組,實驗組A、B、C、D組每組10只,對照組8只。實驗組動物分別在脛骨近端髓腔內(nèi)注入濃度分別為1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108CFU/ml的金黃色葡萄球菌懸液1ml,并在脛骨髓腔內(nèi)置入長4.0cm,直徑0.25cm鈦合金棒一根;對照組置入相同規(guī)格的鈦合金棒

8、后注入生理鹽水1ml;(2)分別通過大體觀察、體溫測量、X線檢查、細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)、組織學(xué)觀察、感染率和死亡率評價模型制備效果,篩選建模所需最佳細(xì)菌濃度。
　　4.抗感染金屬植入物對家兔感染模型感染控制作用評價:所有新西蘭大白兔稱量體重、測量體溫后隨機編號,均勻地分為2個實驗組(A組和B組),兔左側(cè)脛骨為實驗側(cè),用來注入菌液建立感染后行材料植入。A組為實驗組,植入復(fù)合抗生素的金屬材料,B組為對照組,植入未復(fù)合抗生素的金屬材料,取材時間點

9、為術(shù)后2周、4周和8周。所有動物行脛骨側(cè)位X線檢測,各時間點取材后進(jìn)行大體觀察,細(xì)菌培養(yǎng)和HE染色組織學(xué)觀察。
　　結(jié)果
　　1.鈦合金表面多巴胺修飾的細(xì)胞相容性檢查: MTT法測定兩組材料各時間點的吸光值后,采用Wilcoxon秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析,分析結(jié)果顯示,第1天兩組之間材料表面細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。第3,5,7,9天,未涂層組材料表面數(shù)量略高于涂層組,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義((Pa<0.01,Pb<0.05),表

10、明多聚多巴胺涂層對材料表面的細(xì)胞增殖有負(fù)面影響,但影響程度較輕。兩組材料上鈣黃綠素綠染的細(xì)胞證實,活細(xì)胞生長狀況良好,涂層組凋亡細(xì)胞多于未涂層組,實驗結(jié)果與 MTT測定結(jié)果相符。
　　2.復(fù)合材料的體內(nèi)生物相容性檢測:流式細(xì)胞測定結(jié)果的方差分析顯示,術(shù)后第一周,涂層材料組的CD4/CD8比值同切開縫合組相比無統(tǒng)計學(xué)差異,而未涂層材料組的CD4/CD8比值顯著低于其他兩組(P<0.01),第二周和第三周的測定結(jié)果與第一周結(jié)果類似。第

11、六周時,三組之間的CD4/CD8比值均無顯著差異。組織學(xué)觀察結(jié)果顯示,1、2、3、6W時,未涂層組與涂層組相比,纖維組織增生明顯,炎細(xì)胞浸潤較多。涂層組隨時間增長,纖維增生和炎細(xì)胞浸潤大大減少,未涂層組6W時依然可見明顯的纖維組織增生和炎癥細(xì)胞浸潤。
　　3.感染動物模型制備結(jié)果:模型動物在最初兩周局部軟組織出現(xiàn)腫脹,體溫明顯升高隨后降到正常。術(shù)后4周影像學(xué)顯示實驗組動物患肢出現(xiàn)骨膜反應(yīng)、骨壞死及髓腔纖維化等表現(xiàn),細(xì)菌培養(yǎng)顯示實驗

12、組中感染程度隨接種細(xì)菌濃度增高而加劇, C、D兩組感染率為100％,接種1.0×107(CFU)/ml濃度細(xì)菌的C組具有最高的成活率為80%,D組具有最高的死亡率為70%。術(shù)后4周病理學(xué)觀察到骨纖維化、骨壞死等典型感染表現(xiàn)。
　　4.抗感染金屬植入物對家兔感染模型的感染控制作用評價:對實驗動物的術(shù)后X線隨訪發(fā)現(xiàn),2周時實驗組(A組)與對照組(B組)均有骨膜反應(yīng)表現(xiàn);4周和8周時對照組的骨膜反應(yīng)加重同時有骨質(zhì)溶解破壞和死骨出現(xiàn)。細(xì)菌

13、培養(yǎng)結(jié)果顯示,實驗組骨組織和植入物培養(yǎng)結(jié)果一致,培養(yǎng)板上未培養(yǎng)出菌落,表明實驗組復(fù)合材料在家兔感染模型上發(fā)揮了明顯的殺菌、抑菌作用。而對照組的培養(yǎng)板上幾乎長滿了白色菌落,表明對照組骨組織和植入物表面存在大量細(xì)菌,兩組差異明顯。組織學(xué)觀察結(jié)果顯示實驗組脛骨組織學(xué)切片鏡下,髓腔脂肪細(xì)胞排列規(guī)則,結(jié)構(gòu)完整,造血細(xì)胞充滿脂肪細(xì)胞間隙,脛骨皮質(zhì)層結(jié)構(gòu)完整,排列緊密,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,可見明顯的細(xì)胞核存在。對照組為復(fù)合空白微球材料組,動物脛骨髓腔組織病

14、理學(xué)可見髓腔梗死及纖維化,漿細(xì)胞和單核細(xì)胞積聚髓腔,正常的空泡狀脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失而被大量膿液占據(jù),髓腔側(cè)及皮質(zhì)骨內(nèi)可見壞死骨片,并且隨時間延長,對照組壞死骨片范圍擴大。
　　結(jié)論
　　1.鈦合金表面多聚多巴胺涂層修飾在體外實驗中會對細(xì)胞黏附造成輕微的負(fù)面影響,鈣黃綠素染色發(fā)現(xiàn)多巴胺涂層無明顯的生物毒性。明膠微球的復(fù)合使材料在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的生物相容性。
　　2.成功構(gòu)建出骨科金屬植入物并發(fā)感染的動物模型,該模型制備