大豆疫霉病原相關(guān)模式分子PsXEG1的免疫活性和毒性功能分析.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthora sojae）侵染大豆引起的大豆根腐病是大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害之一。在自然選擇過程中大豆疫霉容易發(fā)生變異，產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致一些殺菌劑喪失防治效果，所以長期以來由大豆疫霉引起的病害很難防治。
　　在病原菌與植物互作的過程中，植物細胞膜表面的模式識別受體能夠識別病原菌的病原相關(guān)模式分子(PAMPs)，從而激發(fā)免疫反應(yīng)抵抗病原菌的侵染。病原相關(guān)模式分子(PAMPs)廣泛存在于一系列微生物中，其結(jié)構(gòu)保守且

2、對微生物的生長發(fā)育以及生存都具有非常重要的作用。對病原相關(guān)模式分子作用機制的研究，有利于我們通過抗病基因工程技術(shù)對PAMPs的受體進行改造，以獲得更加廣譜且高效的抗病品種。因此，本文對大豆疫霉病原相關(guān)模式分子XEG1的免疫活性和毒性機制進行了分析，發(fā)現(xiàn)以XEG1為代表的GH12家族的蛋白能夠誘發(fā)植物一系列的免疫反應(yīng);同時PsXEG1是一個毒性因子，對大豆疫霉的致病性是必須的，并且其毒性功能來源于糖基水解酶的活性。本文主要研究內(nèi)容如下:<

3、br>　　一、卵菌GH12蛋白的免疫活性分析。本研究對實驗室前期鑒定到的病原相關(guān)模式分子XEG1的免疫活性進行分析，發(fā)現(xiàn)XEG1不僅能在本氏煙草中觸發(fā)細胞死亡，還能誘導(dǎo)煙草中防衛(wèi)基因的表達和多種防衛(wèi)相關(guān)物質(zhì)的積累，包括活性氧的迸發(fā)和胼胝質(zhì)的積累。這些結(jié)果說明XEG1能夠在植物中誘發(fā)典型的PTI反應(yīng)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，XEG1及其在卵菌5個不同種中的43個同源蛋白都屬于糖基水解酶12家族，該家族的蛋白具有保守的糖基水解酶功能域。利用農(nóng)桿

4、菌介導(dǎo)的PVX病毒表達系統(tǒng)，在本氏煙草葉片上通過農(nóng)桿菌注射的方法瞬時表達XEG1的同源蛋白，發(fā)現(xiàn)來自于卵菌不同種的GH12蛋白均能激發(fā)煙草細胞的過敏性壞死。綜上所述，XEG1能夠激發(fā)典型的PTI反應(yīng)，包括活性氧迸發(fā)、胼胝質(zhì)積累、防衛(wèi)基因的表達和過敏性細胞壞死;同時XEG1這類蛋白在卵菌中廣泛存在，且同源蛋白具有誘發(fā)植物細胞過敏性壞死的活性。
　　二、PsXEG1毒性機制的分析。PsXEG1屬于大豆疫霉GH12家族，是一個糖基水解酶

5、。實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)，PsXEG1在大豆疫霉侵染早期明顯上調(diào)表達，在大豆疫霉中沉默PsXEG1會降低其致病性，表明PsXEG1參與了大豆疫霉的致病過程。隨著CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)在疫霉菌中的成功應(yīng)用，為了更加準(zhǔn)確的分析PsXEG1的毒性機制，我們用CRISPR-Cas9技術(shù)在大豆疫霉中分別敲除PsXEG1和替換PsXEG1為GUS基因序列。發(fā)現(xiàn)兩種敲除形式都不影響大豆疫霉的正常生長，但是其致病力都顯著下降，此結(jié)果表明Ps

6、XEG1是一個毒性因子。為了進一步明確PsXEG1的毒性機制，我們把大豆疫霉基因組中的PsXEG1基因序列替換為PsXEG1的酶活喪失突變體PsXEG1E136D&E222D的基因序列，對該轉(zhuǎn)化子進行生長速率和致病力測定。發(fā)現(xiàn)PsXEG1的酶活喪失并不影響大豆疫霉的生長，但是其致病力顯著下降，而且該轉(zhuǎn)化子的致病力和PsXEG1敲除突變體一致。以上結(jié)果表明，在大豆疫霉侵染大豆過程中，PsXEG1是一個毒性因子，通過其糖基水解酶活性來發(fā)揮毒