術(shù)前負(fù)荷量瑞舒伐他汀對PCI圍手術(shù)期的心肌保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、術(shù)前負(fù)荷量瑞舒伐他汀對PCI圍手術(shù)期的心肌保護(hù)作用
　　背景：他汀類藥物對PCI過程中的保護(hù)作用目前已有大量的證據(jù)，如ARMYDA研究證實(shí)術(shù)前大劑量阿托伐他汀可以減少穩(wěn)定性心絞痛患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(Percutaneous coronary intervention，PCI)過程中對心肌的損傷。ARMYDA-ACS試驗(yàn)證實(shí)了術(shù)前給予短期阿托伐他汀預(yù)處理的急性冠脈綜合癥患者接受早期介入治療時(shí)同樣獲益。ARMYDA R

2、ECAPTURE研究證實(shí)對于長期服用阿托伐他汀的冠心病患者在PCI術(shù)前給予大劑量阿托伐他汀依然能夠改善臨床預(yù)后。
　　上述研究均采用阿托伐他汀，而作為一種比阿托伐他汀作用更強(qiáng)效的他汀藥物，瑞舒伐他汀近幾年已成為研究熱點(diǎn)。關(guān)于他汀類藥物的PCI圍術(shù)期保護(hù)作用，到目前為止，僅有韓國和意大利的兩項(xiàng)研究采用了瑞舒伐他汀，研究發(fā)現(xiàn)ACS患者或穩(wěn)定性心絞痛患者PCI術(shù)前給予單一大劑量瑞舒伐他汀可減少術(shù)中心肌損傷，提高12個(gè)月的臨床結(jié)果。

3、>　　他汀類藥物對PCI術(shù)相關(guān)的心肌梗死的保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚，以前的研究提示這種作用很可能與他汀類藥物的非調(diào)脂作用（“多效性”作用）有關(guān)，這些作用包括抗炎、改善內(nèi)皮功能功能、穩(wěn)定斑塊、抑制血栓形成等，但瑞舒伐他汀的圍術(shù)期保護(hù)作用是否與此相關(guān)，目前尚不完全明了。
　　目的：
　　1.證實(shí)接受擇期PCI的非ST段抬高ACS患者術(shù)前應(yīng)用負(fù)荷量瑞舒伐他汀是否可以減少心肌損傷。
　　2.證實(shí)其對PCI圍術(shù)期炎癥因子的影響，進(jìn)而

4、探討其心肌保護(hù)作用的機(jī)制。
　　方法：
　　1.入組人員
　　本研究為一項(xiàng)隨機(jī)、前瞻性、雙盲、安慰劑對照試驗(yàn)，125例非ST段抬高性ACS患者被隨機(jī)分為瑞舒伐他汀組（PCI術(shù)前2-4小時(shí)給予20 mg，n=62）和安慰劑組(n=63)。
　　2.PCI術(shù)前及術(shù)后處理所有受試者給予口服阿司匹林（100mg/天）和氯吡格雷（75mg/天），術(shù)前總劑量至少達(dá)到300mg，術(shù)后予低分子量肝素3至5天，氯吡格雷（75mg/

5、天）至少12個(gè)月，瑞舒伐他?。?0mg/晚）至少一個(gè)月，阿司匹林（100mg/天）則盡可能長時(shí)間用。
　　3.血液樣本收集每例患者的血標(biāo)本分4個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集（PCI術(shù)前，術(shù)后6小時(shí)、24小時(shí)、3天）。
　　4.實(shí)驗(yàn)室檢查檢測PCI術(shù)前及術(shù)后6小時(shí)、24小時(shí)、3天CK-MB，CTNI，hs-CRP，IL-6及MCP-1水平。
　　CK-MB含量測定采用免疫熒光法， CTNI測定使用化學(xué)發(fā)光法，hs-CRP測定采用免疫比濁法

6、，IL-6、MCP-1水平測定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。
　　5.主要和次要的終點(diǎn)主要終點(diǎn)事件指PCI術(shù)后30天內(nèi)發(fā)生的嚴(yán)重心臟不良事件(MACEs)，包括心源性猝死，心肌梗塞和接受血運(yùn)重建治療。
　　次要終點(diǎn)事件指PCI術(shù)后30天內(nèi)心肌標(biāo)志物的升高。
　　結(jié)果：
　　1.兩組的臨床特點(diǎn)兩組患者有相似的基線特征，包括年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙、心室射血分?jǐn)?shù)、血脂水平、肌酐水平、臨床表現(xiàn)和住院用藥（P＞0.

7、05）。
　　2.冠脈造影和PCI術(shù)中的特點(diǎn)兩組間冠狀動(dòng)脈解剖、造影過程、使用藥物洗脫支架、支架直徑和長度、GPⅡb/Ⅲa抑制劑的應(yīng)用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。血管造影的并發(fā)癥發(fā)生率分別為瑞舒伐他汀組8例(13.0％)和對照組9例(14.3％)，(P=0.82)。
　　3.主要終點(diǎn)事件術(shù)后30天時(shí)評估主要終點(diǎn)事件，死亡、心肌梗死、靶血管的再血管化等終點(diǎn)事件發(fā)生率瑞舒伐他汀組為8.1％(5/62)，安慰劑組為22.2％(14/63)(P＜

8、0.01)，一個(gè)月內(nèi)的嚴(yán)重心臟不良事件全部為術(shù)后心肌梗死(8.1％ vs.22.2％，P＜0.01)。
　　4.次要終點(diǎn)事件術(shù)前瑞舒伐他汀組和安慰劑組的的心肌標(biāo)志物情況相似，但PCI術(shù)后瑞舒伐他汀組中CK-MB和CTNI的升高比例明顯要低。
　　5.兩組hs-CRP，IL-6和MCP-I的改變水平瑞舒伐他汀組和對照組的hs-CRP，IL-6和MCP-I基線水平?jīng)]有明顯差異，PCI術(shù)后6小時(shí)、24小時(shí)、3天兩組的hs-CRP、

9、IL-6水平均明顯升高，但瑞舒伐他汀組升高幅度明顯低于對照組。兩組的MCP-I水平在PCI術(shù)后也有明顯的改變，但這兩組間沒有明顯的差異。
　　結(jié)論：
　　1.本研究證實(shí)非ST段抬高的ACS患者PCI術(shù)前給予大劑量的瑞舒伐他汀能夠減少術(shù)后心肌梗死的發(fā)生。
　　2.瑞舒伐他汀這種心臟保護(hù)作用可能是通過抑制IL-6和CRP來完成的。
　　第二部分、瑞舒伐他汀在心肌缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用
　　背景：近年來，動(dòng)脈

10、搭橋術(shù)、溶栓療法、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈血管成形術(shù)、體外循環(huán)心臟外科手術(shù)和心肺腦復(fù)蘇術(shù)等手段的建立和推廣應(yīng)用，使得缺血心臟能在短時(shí)間內(nèi)重新獲得血液灌注并恢復(fù)氧供應(yīng)。多數(shù)情況下，缺血后再灌注可使損傷的結(jié)構(gòu)得到修復(fù)、心功能恢復(fù)、病情好轉(zhuǎn);但有時(shí)不僅不能使心功能恢復(fù)，反而會(huì)加重心臟功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。這種在心肌缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷加重、甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemiareperfusion

11、 injury，MIRI)，其中心肌細(xì)胞凋亡在缺血再灌注所致?lián)p傷中發(fā)揮了重要作用。研究證實(shí)調(diào)控細(xì)胞凋亡有3條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它們分別是線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulunstress，ERS)啟動(dòng)的凋亡途徑是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)會(huì)導(dǎo)致一系列蛋白產(chǎn)物的表達(dá)異常，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP

12、78)、C/EBP同源蛋白(C/EBPhomologous protein，CHOP)和Caspase-12這三種蛋白是具有代表性的，研究表明是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白產(chǎn)物。
　　葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78被認(rèn)為是HsP70家族的成員之一。GRP78的功能很多，它作為一種分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，它也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種應(yīng)激蛋白，在低糖、低氧、低Ca2+等應(yīng)激狀態(tài)下大量表達(dá)以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定，保護(hù)細(xì)胞。GRP78通過ADP-核糖基化作用

13、保存細(xì)胞內(nèi)有限的營養(yǎng)。GRP78還能降低細(xì)胞對殺傷性T細(xì)胞的敏感性，阻止細(xì)胞凋亡。GRP78還參與分泌性蛋白的合成和運(yùn)輸，另外它通過介導(dǎo)蛋白質(zhì)的構(gòu)型變化以參與生物信號傳遞旁路系統(tǒng)的構(gòu)筑。
　　CHOP(C/EBP homologous protein)又名GADD153(Gmwth Arrest and DNADamage)，是C/EBP(CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白)家族成員之一，與各種細(xì)胞活動(dòng)如能量代謝、增殖、分化及凋亡相關(guān)。其

14、存在于多種組織細(xì)胞中，正常生理情況下幾乎不表達(dá)，當(dāng)其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)含量增高時(shí)細(xì)胞趨于生長抑制或凋亡，提示其過表達(dá)可能誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。當(dāng)缺血、缺氧等不同的細(xì)胞外信號刺激可激活胞內(nèi)的不同轉(zhuǎn)錄因子，這些被激活的轉(zhuǎn)錄因子由胞漿轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與CHOP基因調(diào)控元件結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)CHOP轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。
　　半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase12)是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族的一員。該家族在機(jī)體調(diào)控細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)方面有一定作用。

15、Caspase-12的激活是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡途徑之一。當(dāng)缺血再灌注發(fā)生時(shí)，Caspase-12被激活，它可以引起其他Caspase家族活化。被激活的Caspase-12從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入到細(xì)胞液中作用于Caspase-9，激活Caspase-3，最后引起細(xì)胞凋亡。
　　已有的研究證實(shí)，他汀可以通過改善內(nèi)皮功能和抗炎作用等對缺血再灌注損傷起保護(hù)作用，但是否有其他機(jī)制參與其中尚不清楚。國外有學(xué)者證實(shí)辛伐他汀可以通過改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕腦缺

16、血再灌注損傷，因此我們推測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑很可能也是他汀減輕心臟缺血再灌注損傷的重要機(jī)制。本研究中，我們擬以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)瑞舒伐他汀在心肌缺血再灌注損傷中對于多種損傷相關(guān)蛋白(GRP78、CHOP、Caspase-12)表達(dá)以及基因水平的影響，以期探討瑞舒伐他汀在缺血再灌注損傷中的病理生理意義。
　　目的：
　　1.構(gòu)建大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。
　　2.研究瑞舒伐他汀在心肌缺血再灌注損傷中對于GRP78、CHOP、

17、caspase-12基因以及蛋白產(chǎn)物的影響。
　　3.探討瑞舒伐他汀在心肌缺血再灌注損傷中的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：
　　1.缺血再灌注心肌損傷模型的構(gòu)建90只Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，隨機(jī)分為3組:藥物組（n=30只），對照組（n=30只），假手術(shù)組（n=30只）。藥物組給予瑞舒伐他汀灌胃3天，20mg×Kg-1×d-1，對照組和假手術(shù)組給予清水灌胃3天。之后所有組的大鼠再分別隨機(jī)分為3組:心梗6小時(shí)組（n=1

18、0只），心梗24小時(shí)組（n=10只），心梗48小時(shí)組（n=10只）。大鼠仰臥位四肢固定好，去毛，上界為胸骨上緣水平，下界為胸骨下緣水平。延胸骨左緣3mm左右作一約1.5-2cm長縱行切口，手術(shù)刀切開皮膚，逐層鈍性分離肌肉，顯露出胸膜，用止血鉗刺破胸膜，進(jìn)入胸腔。以無菌棉球沾生理鹽水后將肺壓向左側(cè)胸腔以保護(hù)肺臟，用眼科剪剪開心包膜，暴露左心耳，從左心耳下方2-3mm人針，以5-0或6-0的縫合線進(jìn)行縫扎，（假手術(shù)組只穿線，不結(jié)扎）。

19、>　　2.心肌組織病理學(xué)檢測動(dòng)物處死后，進(jìn)行心肌組織取材、固定、透明、浸蠟、石臘包埋、切片、常規(guī)HE染色，光鏡下觀察心肌3.熒光定量RT-PCR檢測Grp78、CHOP、Caspase12基因表達(dá)分別從梗死灶和非梗死區(qū)提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)得到cDNA，以管家基因β-actin作為參照，通過熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測Grp78、CHOP、Caspase12基因表達(dá)。
　　4.Tune1法檢測凋亡細(xì)胞取組織切片，進(jìn)行凋

20、亡細(xì)胞的免疫組織化學(xué)檢測，所用的一抗是生物素化抗地高辛抗體（SantaCruz公司，1∶100稀釋）
　　5.western-blot檢測Grp78、CHOP、Caspase12蛋白表達(dá)分別從梗死灶和非梗死區(qū)提取總蛋白，經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印記、DAB或ECL顯色等步驟，檢測Grp78、CHOP、Caspase12的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況術(shù)后2小時(shí)

21、內(nèi)死亡4只（對照組3只，藥物實(shí)驗(yàn)組1只），尸體解剖發(fā)現(xiàn)氣管中有大量粘液及血性液體;術(shù)后30小時(shí)死亡3只（對照組組2只，藥物實(shí)驗(yàn)組1只），尸體解剖其中2只發(fā)現(xiàn)有大量胸水，考慮死于心衰，另一只尸體解剖未見異常。
　　2.HE染色結(jié)果假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞大致正常，心肌細(xì)胞間以及血管周圍可見少量淋巴細(xì)胞浸潤;對照組大鼠梗死灶心肌細(xì)胞可見細(xì)胞核增大，部分心肌細(xì)胞退變壞死，心肌細(xì)胞間見多灶炎性細(xì)胞浸潤灶，以淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞為主;藥物組大鼠

22、結(jié)果與對照組相似，但炎癥細(xì)胞浸潤較對照組明顯減少，部分心肌細(xì)胞退變，但較對照組明顯減少。
　　3.TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞核染色為棕黃色，正常細(xì)胞核染色為深藍(lán)色，梗死灶區(qū)心肌細(xì)胞有大量棕黃染色的細(xì)胞核，可以看到胞核有大量固縮、破碎現(xiàn)象，以及被吞噬的凋亡細(xì)胞。非梗死區(qū)棕黃染色的細(xì)胞較少。應(yīng)用計(jì)算機(jī)分析軟件通過高倍視野下棕黃染色面積的計(jì)算，發(fā)現(xiàn)藥物組比對照組棕黃染色面積明顯減少(P＜0.01)。
　　4.熒光定量RT-P

23、CR檢測mRNA表達(dá)Grp78mRNA表達(dá):對照組和藥物組大鼠心肌缺血再灌注6小時(shí)，Grp78mRNA表達(dá)達(dá)峰值，隨后逐漸下降，在相同各時(shí)間點(diǎn)，藥物組Grp78mRNA表達(dá)均明顯高于對照組(P＜0.01)。
　　CHOP mRNA表達(dá):對照組和藥物組大鼠心肌缺血再灌注6小時(shí)， CHOP mRNA表達(dá)開始升高，于48小時(shí)達(dá)高峰，在相同各時(shí)間點(diǎn)比較，藥物組CHOP mRNA表達(dá)均明顯低于對照組(P＜0.01)。
　　Caspas

24、e12 mRNA表達(dá):對照組和藥物組大鼠心肌缺血再灌注6小時(shí)，Caspase12 mRNA表達(dá)開始升高，于24小時(shí)達(dá)高峰，在相同各時(shí)間點(diǎn)比較，藥物組Caspase12 mRNA表達(dá)均明顯低于對照組(P＜0.01)。
　　5.免疫印跡法(Western Blotting)測定各蛋白表達(dá)Grp78蛋白表達(dá):對照組和藥物組大鼠心肌缺血再灌注6小時(shí)，Grp78蛋白表達(dá)最高，在相同各時(shí)間點(diǎn)比較，藥物組Grp78蛋白表達(dá)均明顯高于對照組(P＜

25、0.01)。
　　CHOP蛋白表達(dá):對照組和藥物組大鼠心肌缺血再灌注6小時(shí)，CHOP蛋白表達(dá)開始升高，于48小時(shí)達(dá)高峰，在相同各時(shí)間點(diǎn)比較，藥物組CHOP蛋白表達(dá)均明顯低于對照組(P＜0.01)。
　　Caspase12蛋白表達(dá):對照組和藥物組大鼠心肌缺血再灌注6小時(shí)，Caspase12蛋白表達(dá)開始升高，于24小時(shí)達(dá)高峰，在相同各時(shí)間點(diǎn)比較，藥物組Caspase12蛋白表達(dá)均明顯低于對照組(P＜0.01)。
　　結(jié)論：