腺病毒介導的自身免疫調(diào)節(jié)因子(AIRE)基因修飾對樹突狀細胞性狀及功能影響的研究.pdf

1、目的：建立大鼠骨髓來源的樹突狀細胞體外培養(yǎng)體系，檢測腺病毒對于樹突狀細胞的感染效率，建立AIRE-DC疫苗并鑒定其性狀與生物學功能。
　　方法：（1）取4~6周齡SD大鼠，提取大鼠骨髓細胞，經(jīng)過紅細胞裂解液去除紅細胞，貼壁細胞經(jīng)細胞因子誘導，獲得較高純度的成熟大鼠骨髓源性樹突狀細胞（rBM-DCs），期間每日觀察樹突狀細胞（DC）形態(tài)變化；（2）構建重組AIRE基因的腺病毒載體（Ad），通過腺病毒感染DC進行特定基因修飾，通過流式

2、細胞術以及免疫印跡法驗證Ad對于懸浮生長的rBM-DCs以及貼壁生長的DC2.4細胞株的感染以及基因修飾效率，找出最合適的腺病毒感染復數(shù)；（3）提取鼠全細胞肝癌細胞株RH-35抗原，將AIRE基因修飾的DC負載腫瘤抗原，檢測表面分子CD83、CD86、CD11c的mRNA表達水平，并通過流式細胞術檢測CD80、和MHC-II的表達，研究AIRE基因?qū)τ跇渫粻罴毎誀钜约吧飳W功能影響。
　　結果：（1）骨髓細胞懸液經(jīng)各類處理以及細

3、胞因子誘導后可獲得較高純度的DC，且隨著培養(yǎng)時間的增長，DC細胞逐漸增大，表現(xiàn)出明顯的樹枝樣或者細足樣分叉和突起，并從半貼壁生長逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁生長；（2）腺病毒對于DC2.4細胞株以及rBM-DCs均具有較高的感染效率，且均能成功對DC進行修飾，其中DC2.4的最適感染復數(shù)為50MOI，感染效率可達90％以上；rBM-DCs的最適感染復數(shù)為100MOI，感染效率為70%左右，更高的感染復數(shù)則會產(chǎn)生較大細胞毒性；（3）經(jīng)AIRE基因修飾過

4、的rBM-DCs經(jīng)過腫瘤抗原負載的條件下表現(xiàn)出各類細胞表面分子的顯著表達上升，CD80、CD83、CD11c與未處理組相比具有顯著性差異（p<0.05)，CD86和MHC-II類分子與未處理組相比差異非常顯著（p<0.01），同時轉(zhuǎn)染空載體的rBM-DCs表面分子與為處理組相比無顯著性差異。而DC2.4在感染前后表面分子表達均較低且無顯著性差異。
　　結論：
　　1.腺病毒對于原代DC以及DC細胞株均具較高的感染效率，但對于

5、細胞株的感染效率更高；
　　2.腺病毒對rBM-DCs的最適感染復數(shù)較DC2.4高，懸浮細胞相對于貼壁細胞較難感染；
　　3. AIRE可以增高負載抗原后的rBM-DCs表面分子CD80、CD83、CD86、CD11c和MHC-II類表達，其中CD86和MHC-II類分子表達顯著增高。
　　4. DC2.4細胞株缺乏DC細胞應該表達的各類表面分子，且腫瘤全細胞抗原刺激后表達亦沒有顯著變化，表明其經(jīng)過正常細胞永生化處理，