自身免疫調(diào)節(jié)因子對(duì)大分子自噬及細(xì)胞吞噬功能的影響.pdf

1、目的
　　 自身免疫調(diào)節(jié)因子（AIRE）具有誘導(dǎo)中樞免疫耐受的潛能，但在外周免疫耐受中，其功能未明?？紤]大分子自噬可參與免疫耐受的誘導(dǎo)，我們初步探討了自身免疫調(diào)節(jié)因子在外周中的表達(dá)及其對(duì)外周單核細(xì)胞系THP-1大分子自噬的影響。
　　 方 法
　　 真核表達(dá)載體Pegfp-AIRE經(jīng)雙限制性酶切、PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序分析鑒定；依據(jù)密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞及單核細(xì)胞的分離；THP-1細(xì)胞由佛波

2、醇酯誘導(dǎo)分化后通過瑞氏-姬姆薩染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；細(xì)胞轉(zhuǎn)染按脂質(zhì)體法進(jìn)行；AIRE表達(dá)抑制采用siRNA的方法；熒光顯微鏡觀察GFP-AIRE融合蛋白的表達(dá)和亞細(xì)胞定位；轉(zhuǎn)染效率經(jīng)RT-PCR與Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證；自噬小體在胞內(nèi)的形成和定位通過間接免疫熒光染色指示；大分子自噬的抑制采用PI3K抑制劑（渥曼青霉素）進(jìn)行誘導(dǎo)；LC3B-Ⅱ與p62/SQSTM1的蛋白表達(dá)變化經(jīng)Western Blot進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)

3、 果
　　 質(zhì)粒DNA經(jīng)雙酶切、PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳后可見特異性條帶；DNA測(cè)序結(jié)果顯示測(cè)定序列與AIRE（NM_000383.2）基因序列符合率99％（BLAST評(píng)分1698）。外周血單個(gè)核細(xì)胞、單核細(xì)胞、U937和THP-1細(xì)胞存在AIRE Mrna表達(dá)；單核細(xì)胞和THP-1細(xì)胞僅表達(dá)低水平AIRE蛋白。誘導(dǎo)后，THP-1細(xì)胞呈貼壁生長，胞體增大，形態(tài)多樣性，核不規(guī)則，胞漿內(nèi)空泡，吞噬細(xì)胞碎片等典型成熟分化形態(tài)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)

4、染48小時(shí)后，熒光顯微鏡顯示GFP-AIRE融合蛋白以斑點(diǎn)狀定位于細(xì)胞核內(nèi)；在Mrna和蛋白水平，AIRE均呈明顯高表達(dá)；而AIRE siRNA則明顯抑制GFP-AIRE融合蛋白及AIRE Mrna與蛋白的表達(dá)。過表達(dá)AIRE可上調(diào)LC3B-Ⅱ的表達(dá)和自噬小體的形成；而大分子自噬抑制劑與AIRE siRNA可抑制AIRE介導(dǎo)的上調(diào)效應(yīng)。過表達(dá)AIRE或大分子自噬抑制劑與AIRE siRNA對(duì)p62/SQSTM1蛋白表達(dá)無影響。
　

5、　 結(jié) 論
　　 真核表達(dá)載體Pegfp-AIRE構(gòu)建正確，可應(yīng)用于體外轉(zhuǎn)染研究。AIRE可表達(dá)于外周單核細(xì)胞并通過上調(diào)LC3B-Ⅱ的表達(dá)和自噬小體的形成促進(jìn)單核細(xì)胞大分子自噬。AIRE介導(dǎo)單核細(xì)胞大分子自噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能與p62/SQSTM1蛋白無關(guān)。通過促進(jìn)單核細(xì)胞大分子自噬，AIRE可能在外周免疫耐受中具有功能。
　　 第二部分 自身免疫調(diào)節(jié)因子與凋亡細(xì)胞的吞噬清除
　　 目的
　　 凋亡細(xì)胞

6、是自身抗原成分的主要來源之一，適時(shí)清除凋亡細(xì)胞對(duì)維持免疫自穩(wěn)具有重要意義。作為細(xì)胞死亡的兩種不同形式——大分子自噬與凋亡共享許多調(diào)節(jié)因子，基于本文第一部分研究結(jié)果，為繼續(xù)探討自身免疫調(diào)節(jié)因子（AIRE）在外周免疫耐受中的功能，我們?cè)诜恰奥殬I(yè)”吞噬細(xì)胞——上皮細(xì)胞系16HBE中探討了AIRE對(duì)吞噬凋亡細(xì)胞的影響。
　　 方 法
　　 16HBE細(xì)胞的轉(zhuǎn)染使用來源于第一部分研究的真核表達(dá)載體Pegfp-AIRE通過FuGEN

7、E HD轉(zhuǎn)染法進(jìn)行；轉(zhuǎn)染效率經(jīng)熒光顯微鏡、RT-PCR與Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證；HL-60細(xì)胞的凋亡由喜樹堿誘導(dǎo)后通過Annexin V-FITC/碘化丙啶雙染色進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)；吞噬凋亡細(xì)胞的檢測(cè)通過髓過氧化物酶(MPO)染色進(jìn)行顯示；吞噬相關(guān)基因（Rac 1）的表達(dá)變化經(jīng)RT-PCR與Western Blot進(jìn)行檢測(cè)。結(jié) 果
　　 Pegfp-AIRE轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，熒光顯微鏡顯示GFP-AIRE融合蛋白以斑點(diǎn)狀

8、定位于16HBE細(xì)胞核內(nèi)；通過RT-PCR與Western Blot檢測(cè)，AIRE Mrna和蛋白均呈明顯高表達(dá)。對(duì)比未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)的陰性對(duì)照組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，喜樹堿誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡率上升約3倍[（4.08±0.26）％vs（13.46±1.71）％]。在與凋亡細(xì)胞共孵育1小時(shí)后，可見轉(zhuǎn)AIRE基因16HBE細(xì)胞吞噬率為（25.5±3.67）％，而轉(zhuǎn)染空載體16HBE細(xì)胞吞噬率為（6.25±1.58）％，兩者間具有顯著性差異

9、（P＜0.05）；但過表達(dá)AIRE對(duì)16HBE細(xì)胞吞噬未凋亡細(xì)胞無明顯影響[（1.0±0.67）％]。同時(shí)，過表達(dá)AIRE可上調(diào)16HBE細(xì)胞Rac 1Mrna和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié) 論
　　 16HBE細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞具有基礎(chǔ)吞噬率，可作為體外研究吞噬凋亡細(xì)胞的細(xì)胞模型。MPO染色法對(duì)檢測(cè)吞噬來源于MPO陽性靶細(xì)胞的吞噬效應(yīng)具有較好對(duì)比度，可作為體外顯示吞噬效應(yīng)的檢測(cè)方法。AIRE可促進(jìn)上皮細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬，通過上調(diào)