適量酒精對(duì)棕櫚酸引起的胰島β細(xì)胞功能損傷的保護(hù)作用.pdf

1、流行病學(xué)調(diào)查顯示:飲酒和2型糖尿病之間存在著U型關(guān)系,也就是說(shuō)適量飲酒對(duì)抵抗2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮有益的作用,而長(zhǎng)期大量飲酒則增加2型糖尿病發(fā)病的危險(xiǎn)性。同時(shí),高脂飲食導(dǎo)致了游離脂肪酸增加,胰島beta細(xì)胞功能下降,對(duì)葡萄糖的反應(yīng)性下降以及細(xì)胞攝取葡萄糖減少,從而引起了胰島素分泌障礙和胰島素分泌減少,引發(fā)和推進(jìn)糖尿病的”脂毒性”。由此可見,無(wú)論是過(guò)量攝入酒精還是高脂飲食均能損害胰島功能,均是2型糖尿病發(fā)病的常見獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前,國(guó)內(nèi)

2、外的研究也多關(guān)注在飲酒或高脂這兩個(gè)因素單獨(dú)對(duì)糖尿病的影響而很少將二者放在一起比較。但是我們的日常生活中,人們?cè)陲嬀频耐瑫r(shí)也攝入了大量脂肪,那么這兩種因素同時(shí)存在時(shí)又會(huì)對(duì)2型糖尿病的發(fā)病產(chǎn)生怎樣的影響?我們前期的研究發(fā)現(xiàn)適量飲酒改善高脂誘發(fā)的脂肪胰島素抵抗。由此,我們產(chǎn)生疑問:高脂環(huán)境下,適量酒精對(duì)2型糖尿病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)--β細(xì)胞作用如何?
　　 腺苷酸環(huán)化激酶(AMPK)作為機(jī)體的能量檢測(cè)器,密切觀察細(xì)胞的能量狀態(tài)?，F(xiàn)在對(duì)于A

3、MPK的作用已經(jīng)基本肯定的是促進(jìn)外周對(duì)葡萄糖的攝取;促進(jìn)脂肪氧化;抑制肝臟的脂肪酸和膽固醇合成;抑制脂肪細(xì)胞的脂肪酸合成和甘油三酯分解。在胰島β細(xì)胞,葡萄糖是可以通過(guò)氧化代謝直接改變細(xì)胞內(nèi)的腺苷酸水平來(lái)影響AMPK的活化,表現(xiàn)為高糖抑制AMPK的活性。那么,酒精和/脂肪酸是否通過(guò)AMPK影響胰島素的分泌呢?
　　 胰腺十二指腸同源異型盒因子-1(PDX-1)是胰腺發(fā)育和胰島素啟動(dòng)子的重要的轉(zhuǎn)錄因子,能進(jìn)入細(xì)胞核與胰島素基因相結(jié)合

4、引起胰島素的mRNA轉(zhuǎn)錄,對(duì)beta細(xì)胞內(nèi)分泌功能起重要調(diào)控作用。而葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)則隸屬于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(GLUTs),能催化血中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn),促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入胰島beta細(xì)胞內(nèi),與葡萄糖激酶(GCK)共同形成葡萄糖感受器,調(diào)節(jié)胰島beta細(xì)胞的胰島素分泌,主要受PDX-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。PDX-1和GLUT2表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)胰島素釋放和含量。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在觀察酒精,飽和游離脂肪酸(棕櫚酸)以及二者合用時(shí)(酒加脂

5、)分別對(duì)胰島β細(xì)胞(INS-1細(xì)胞)功能的影響,從胰島素分泌量,調(diào)節(jié)胰島素基因關(guān)鍵分子PDX-1及其下游葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)分子GLUT2和能量感受器AMPK蛋白表達(dá)這幾個(gè)方面評(píng)價(jià)INS-1細(xì)胞的功能。
　　 目的:
　　 1.觀察酒精,棕櫚酸以及二者合用時(shí)(酒加脂)對(duì)胰島β細(xì)胞(INS-1細(xì)胞)胰島素釋放功能的影響。
　　 2.觀察酒精,棕櫚酸以及二者合用時(shí)(酒加脂)對(duì)胰島β細(xì)胞(INS-1細(xì)胞)中調(diào)節(jié)胰島素基因關(guān)鍵分子

6、PDX-1及其下游葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)分子GLUT2和能量感受器AMPK蛋白水平的影響。
　　 方法:
　　 1.INS-1細(xì)胞在含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素、50μMβ-巰基乙醇、0.133 g/L丙酮酸鈉的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、5％C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合80-90％時(shí)用胰酶消化后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿(106個(gè)/皿)或24孔板(2×105個(gè)/孔)中,48h時(shí)分組處理。分為六個(gè)組:

7、正常對(duì)照組,20 mmol/L乙醇(20 mmol/L Etoh)組,100 mmol/L乙醇(100 mmol/L EtOH)組,0.2 mmol/L棕櫚酸(PA)組,PA+20 mmol/L EtOH(PA+20 mmol/L EtOH)組和PA+100 mmol/L EtOH(PA+100 mmol/L EtOH)組,孵育48h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2.胰島素釋放實(shí)驗(yàn):INS-1細(xì)胞種于24孔板中,分組處理后,在葡萄糖濃度

8、為3.3mmol/L、27.8 mmol/L的KRB緩沖液中分別37℃孵育40分鐘,收集上清液,放射免疫方法測(cè)定分泌的胰島素水平分別為基礎(chǔ)胰島素分泌(BIS)和葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)。
　　 3.PDX-1、GLUT2、AMPK的檢測(cè):在INS-1細(xì)胞上Westemblotting檢測(cè)PDX-1、GLUT2、AMPK蛋白水平表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同處理因素對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響<

9、br>　　 與對(duì)照組的基礎(chǔ)胰島素量(BIS)相比,除了PA組BIS顯著增加了48％外,其余各組BIS均無(wú)明顯差異;與PA組相比,只有100 mmol/L EtOH組BIS顯著降低。與對(duì)照組葡萄糖刺激的胰島素釋放量(GSIS)相比,20 mmol/L EtOH(模擬適量飲酒)和PA+20 mmol/L EtOH兩GSIS都沒有明顯變化;100 mmol/L EtOH(模擬大量飲酒)組GSIS減低了43％;PA組和PA+100 mmol/

10、L EtOH組GSIS分別下降了41.5％和48％。與PA組相比,PA+20 mmol/L EtOH組GSIS明顯增加(增加68.2％),而PA+100 mmol/L EtOH組沒有發(fā)現(xiàn)增加胰島素釋放的現(xiàn)象。
　　 相應(yīng)地,圖1還顯示相對(duì)于對(duì)照,20 mmol/L EtOH組和PA+20 mmol/L EtOH組的胰島素分泌指數(shù)(ISI)沒有顯著變化,而100 mmol/L EtOH組,PA組和PA+100mmol/L EtOH

11、組的ISI則分別降低了36.3％,47％及41.6％。由此可見與酒精相比,PA對(duì)ISI的影響更明顯。相對(duì)于PA組,PA+20mmol/L EtOH組的ISI顯著升高了47.1％,而PA+100 mmol/L EtOH組則沒有明顯差異。
　　 2.2不同處理組INS-1細(xì)胞PDX-1表達(dá)的變化
　　 結(jié)果顯示與胰島素釋放實(shí)驗(yàn)相一致,與對(duì)照相比,20 mmol/L EtOH組和PA+20 mmol/L EtOH組無(wú)明顯影響;

12、100 mmol/L EtOH組,PA組以及PA+100 mmol/LEtOH組PDX-1水平明顯降低,分別下降了21.5％(*p＜0.05),30％(*p＜0.05)和23％(*p＜0.05)。由此可見,與兩個(gè)酒精組相比,棕櫚酸(PA)組對(duì)細(xì)胞影響更大(其中PA組PDX-1比20 mmol/L EtOH組表達(dá)量減低更顯著,*P＜0.05)。而PA+20mmol/L ETOH和PA+100mmol/L ETOH兩個(gè)酒加脂組的PDX-1蛋

13、白表達(dá)又比棕櫚酸組分別增加28％(*P＜0.05)和8％(*p＞0.05)。(見圖2)
　　 2.3檢測(cè)不同處理組INS-1細(xì)胞GLUT2表達(dá)的變化
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證問題,本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察作為PDX-1的下游因子GLUT2的變化趨勢(shì)。圖3顯示,與對(duì)照組相比,100 mmol/L EtOH組,PA組和PA+20 mmol/LEtOH組GLUT2水平分別降低了17.6％(*p＜0.05),37.5％(*p＜0.05)以及3

14、0.9％(*p＜0.05)。且從下降幅度來(lái)看,與兩個(gè)酒精組相比,INS-1細(xì)胞對(duì)棕櫚酸反應(yīng)性更敏感。
　　 而與PA組相比時(shí),PA+20mmol/L EtOH組的GLUT2蛋白水平則增加35.4％(*p＜0.05),而0.2PA+lOOmmol/L ETOH組的蛋白表達(dá)沒有明顯的升高。
　　 2.4不同處理組INS-1細(xì)胞AMPK表達(dá)的變化
　　 相對(duì)于對(duì)照組,100 mmol/L EtOH組,PA組以及PA+1

15、00 mmol/L EtOH組T-AMPK表達(dá)分別降低了17.5％,(*p＜0.05),26.7％(*p＜0.05)和20.7％(*p＜0.05),而其余組對(duì)T-AMPK沒有顯著影響。且相對(duì)于兩個(gè)酒精組,PA組的T-AMPK表達(dá)更低。相對(duì)于PA組,PA+20 mmol/L EtOFI組的T-AMPK的表達(dá)明顯改善(*p＜0.05)。
　　 圖4顯示除了PA組AMPK活化(P-AMPK/T-AMPK)相對(duì)于對(duì)照組顯著降低(下降18

16、％,*p＜0.05)以外,其余各組的AMPK活化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。且當(dāng)PA和適量酒精(20 mmol/L ETOH)共培養(yǎng)時(shí),改善了由PA引起的AMPK活化降低(*p＜0.05)。而大量酒精(100 mmol/L EtOH)與PA合用時(shí),卻沒有出現(xiàn)明顯的改善現(xiàn)象。
　　 結(jié)論:
　　 1.大量酒精和PA均能抑制高糖刺激的胰島素釋放并且下調(diào)PDX-1和GLUT2的蛋白表達(dá)水平;大量酒精下調(diào)T-AMPK的表達(dá)但對(duì)AMPK活化(