蓯蓉總苷和松果菊苷對體內外氧化應激阿爾茨海默病模型的作用及機理研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是常發(fā)于老年人的一種癡呆性疾病，其主要病理特征為相對特異性的老年斑生成、神經元纖維纏結和神經元的丟失。研究表明，氧化應激與AD病理過程密切相關。H202或氧自由基是機體正?；虍惓４x過程如β淀粉樣蛋白聚集、多巴胺氧化和腦缺血再灌注的產物。生成的H2O2可以轉變?yōu)楦叨拘缘淖杂苫舻鞍踪|、核酸和生物膜，導致線粒體損傷和鈣超載等現象，誘發(fā)神經元走向凋亡。所以近年來已將氧化應激引起的

2、神經退行性病變和細胞凋亡置于AD研究的中心位置，并將從天然產物中尋找具有抗氧化活性和抗自由基損傷的有效物質作為開發(fā)抗AD新藥的重要途徑。 蓯蓉總苷是從管花肉蓯蓉中提取得到的苯乙醇苷，蓯蓉總苷膠囊由杏輝天力(杭州)藥業(yè)有限公司生產，為SFDA批準的第一個以苯乙醇苷類化合物為主要成分的中藥，對血管性癡呆的癥狀具有顯著緩解作用。研究表明，蓯蓉總苷具有抗氧化和神經細胞保護作用。松果菊苷是1950年第一個從狹葉紫錐菊中分離得到的苯乙醇苷類

3、化合物，是蓯蓉總苷的主要成分(含量>25％)和主要的質量控制指標，也存在于其它植物中。研究表明，松果菊苷能保護肝損傷，對TNF-α誘導的SH-SY5Y細胞凋亡和6-羥基多巴胺引起的急性大鼠紋狀體細胞損傷具有一定的保護作用。但有關其體外對氧化應激所致神經細胞損傷的保護作用研究很少。 本研究擬從氧化應激的角度分別利用整體動物模型和體外細胞模型研究蓯蓉總苷及其主要成分松果菊苷對氧化應激損傷的保護作用和機理，為闡明蓯蓉總苷的部分作用機制

4、和開發(fā)利用松果菊苷提供依據。具體內容和結果如下： 1.蓯蓉總苷可以明顯改善D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉所致AD小鼠的學習記憶，提高小鼠或大鼠腦內Na+-K+ATPase、GSH-Px和SOD的活性，降低NO的含量。 2.MTT法檢測結果顯示，松果菊苷可以明顯提高H2O2損傷的PC12細胞存活率；流式細胞術和Hoechst33342染色法形態(tài)觀察結果表明，松果菊苷可以顯著降低H2O2損傷PC12細胞的凋亡和壞死率，改善DNA片斷

5、化和核固縮，有抗PC12細胞凋亡作用；松果菊苷可以降低H2O2損傷PC12細胞LDH的滲漏。以上實驗結果提示，松果菊苷對H2O2損傷的PC12細胞具有明顯的保護作用。 3.在H2O2損傷PC12細胞模型上，檢測了Na+-K+ATPase，GSH-Px和Caspase-3三種酶活性的變化。研究發(fā)現，松果菊苷提高損傷細胞的Na+-k+ATPase，GSH-Px的活性，但降低Caspase-3的活性。 4.Rhodamine1

6、23和DCF-DA熒光染料結合流式細胞技術檢測結果表明，松果菊苷可以顯著升高損傷細胞的線粒體膜電位(MMP)，降低細胞內活性氧(ROS)水平。 5.Fluo-3和DAF熒光染料結合激光共聚焦檢測結果顯示，H2O2損傷的細胞內[Ca2+]i和NO顯著升高，時程曲線上移。松果菊苷可以使損傷細胞內的[Ca2+]i和NO升高的速度和幅度都明顯減緩，峰值降低。表明降低細胞內[Ca2+]i和NO與松果菊苷抑制PC12細胞凋亡的作用密切相關。

7、 6.本實驗用JC-1結合共聚焦技術進一步研究氧化損傷過程中PC12細胞MMP的變化和松果菊苷的干預作用。研究發(fā)現，用每個細胞的JC-1紅色熒光強度和綠色熒光強度的比值(R)的變化值(R0/Rt)最能體現MMP的變化，未見文獻報道。200μM H2O2使細胞R0/Rt變大，松果菊苷預處理使R0/Rt變小，說明MMP升高。 7.Western blot檢測結果發(fā)現，氧化損傷后PC12細胞Bcl-2低表達但Bax高表達，Ba

8、x/Bcl-2升高，松果菊苷處理有效抑制了H2O2的作用，使Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表達回復到大約原來的水平，Bax/Bcl-2降低，說明抑制Bax表達和增強Bcl-2表達是松果菊苷抑制PC12細胞凋亡的重要機制之一。 8.RT-PCR半定量分析顯示，PC12細胞在H2O2作用下，Bcl-2 mRNA表達顯著降低，p53 mRNA、p65-2 mRNA和iNOS mRNA表達明顯升高。松果菊苷可以拮抗H2O2的作用，逆轉上述

9、基因的表達，從而起到抗凋亡的作用。 本研究得出以下結論：1.蓯蓉總苷可以改善D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉AD模型小鼠的學習記憶，部分作用機理為提高腦內Na+-K+ATPase、GSH-Px和SOD的活性，降低NO的含量。2.松果菊苷對H2O2損傷的PC12細胞損傷和凋亡具有明顯的保護作用，升高Na+-K+ATPase,GSH-Px的活性和MMP、降低細胞內ROS、Ca2+以及NO水平、上調Bcl-2蛋白和mRNA表達但下調p53、p6