牛磺酸對高溫后神經(jīng)上皮細(xì)胞凋亡和分化的影響.pdf

1、研究目的及意義：母體高溫能顯著增加人類和動物子代先天畸形的風(fēng)險。在高溫誘發(fā)的新生兒缺陷中，神經(jīng)管畸形（neural tube defects，NTDs）發(fā)病率高且后果嚴(yán)重，是自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)和新生兒死亡的常見原因。NTDs不僅危及患兒的生命和健康，而且給社會和家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于高溫在自然環(huán)境中難以避免，多種疾病也常常伴有發(fā)熱，孕婦很難避免受其影響，所以尋找有效的預(yù)防和治療高溫致畸的方法，對減少先天畸形的發(fā)生具有重要意義。

2、 研究發(fā)現(xiàn)，多種致畸因子均可通過引起神經(jīng)上皮細(xì)胞過度凋亡而導(dǎo)致NTDs，如：糖尿病妊娠誘發(fā)的NTDs主要是由于高血糖引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激增多，導(dǎo)致神經(jīng)上皮細(xì)胞過度凋亡所致。高溫可抑制神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖，干擾上皮細(xì)胞的位置移動和形態(tài)變化，并使細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞數(shù)目減少，因而兩側(cè)神經(jīng)褶不能正常閉合，導(dǎo)致神經(jīng)管的形成和分化異常，從而形成NTD。因此，若能干擾神經(jīng)上皮細(xì)胞的過度凋亡，就可能會減少NTDs的發(fā)生。 ?；撬崾亲匀唤缰形┮灰?/p>

3、游離狀態(tài)存在的氨基酸。廣泛分布于動物組織細(xì)胞內(nèi)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最豐富的游離氨基酸之一，其含量僅次于谷氨酸。?；撬崤c腦的發(fā)育關(guān)系密切，它能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化、成熟和存活，顯著增加腦重量，在行為上具有提高學(xué)習(xí)與記憶能力的作用。在未成熟大腦，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時，其自身牛磺酸分泌會增加，以拮抗損傷所致的興奮性毒性。外源性?；撬嵋材苻卓辜?xì)胞損傷引起的興奮性毒性，對神經(jīng)細(xì)胞，尤其是發(fā)育時期的腦神經(jīng)細(xì)胞具有重要保護(hù)作用。國內(nèi)外研究結(jié)果均證實(shí)，?；?/p>

4、酸在動物大腦生長發(fā)育中扮演神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)保護(hù)因子的作用，它還作為抗氧化劑和細(xì)胞調(diào)節(jié)因子參與保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。另外，?；撬釋Χ喾N細(xì)胞的鈣離子平衡以及滲透壓平衡的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。還有研究表明，?；撬崮苻卓剐募〖?xì)胞凋亡，促進(jìn)早胚發(fā)育。但關(guān)于?；撬釋Ω邷睾笊窠?jīng)上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，國內(nèi)外尚未見報道。因此，我們提出?；撬釋Ω邷睾蟮纳窠?jīng)上皮細(xì)胞有保護(hù)作用的假說。 本實(shí)驗通過胎鼠神經(jīng)管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，觀察不同高溫條件對神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖

5、活性的影響，以及不同濃度?；撬崛芤簩Ω邷睾笊窠?jīng)上皮細(xì)胞增殖、凋亡和分化的保護(hù)作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制，從而為有效預(yù)防和治療高溫致神經(jīng)管畸形提供實(shí)驗和理論依據(jù)。 研究方法： 1.觀察高溫對體外培養(yǎng)的神經(jīng)上皮細(xì)胞凋亡的影響取孕12.5天小鼠，應(yīng)用體視顯微鏡分離胚胎神經(jīng)管，經(jīng)機(jī)械吹打獲取細(xì)胞懸液，接種于1％血清培養(yǎng)基。應(yīng)用巢蛋白（Nestin）免疫熒光染色技術(shù)鑒定其是否為神經(jīng)上皮細(xì)胞。將培養(yǎng)的神經(jīng)上皮細(xì)胞分為正常對照組

6、和39℃、40℃、41℃三個高溫組，于高溫后12h和24h，采用MTT法及DAPI染色法檢測不同高溫條件對上皮細(xì)胞增殖活性及凋亡的影響，以篩選高溫致神經(jīng)上皮細(xì)胞凋亡的最佳溫度，用于本課題后續(xù)研究。 2.觀察?；撬釋Ω邷睾笊窠?jīng)上皮細(xì)胞增殖及凋亡的影響將培養(yǎng)的神經(jīng)上皮細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組，高溫組及2mM、6mM、10mM、15mM和20mM五個?；撬岜Ｗo(hù)組，采用MTT法測定各組高溫后12h和24h的細(xì)胞增殖活性，用DAPI染色法初

7、步觀察各組神經(jīng)上皮細(xì)胞的凋亡狀況。免疫熒光法測定各組細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)情況，以檢測不同濃度的?；撬崛芤簩Ω邷睾笊窠?jīng)上皮細(xì)胞增殖和凋亡的作用。 3.觀察?；撬釋Ω邷睾笊窠?jīng)上皮細(xì)胞分化的影響細(xì)胞接種培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為含10％胎牛血清的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)神經(jīng)上皮細(xì)胞分化，于高溫后5天用免疫熒光法檢測細(xì)胞中MAP-2和GFAP的表達(dá)情況，以觀察?；撬釋Ω邷睾笊窠?jīng)上皮細(xì)胞分化的保護(hù)作用。 結(jié)果： 1.神經(jīng)上皮

8、細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)的神經(jīng)上皮細(xì)胞胞體為圓形，細(xì)胞界線清楚，培養(yǎng)24h后，細(xì)胞均已貼壁，多數(shù)呈橢圓形或多邊形，胞體飽滿，Nestin和DAPI雙染色結(jié)果顯示，95％以上的細(xì)胞呈Nestin強(qiáng)陽性著色，說明得到的細(xì)胞絕大多數(shù)為神經(jīng)上皮細(xì)胞。 2.高溫對體外培養(yǎng)的神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖活性和凋亡的影響 MTT法檢測結(jié)果顯示，高溫可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖活性降低，且溫度越高細(xì)胞活性越低。DAPI染色結(jié)果顯示，高

9、溫可引起體外培養(yǎng)的神經(jīng)上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，溫度越高凋亡細(xì)胞越多。其中40℃培養(yǎng)細(xì)胞30min引起的細(xì)胞活性和凋亡的變化最適宜于后續(xù)實(shí)驗研究。 3.牛磺酸對高溫后神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響 MTT法檢測結(jié)果顯示，在五個不同濃度的?；撬峤M中，只有6mM和10mM?；撬峤M的細(xì)胞增殖活性顯著高于高溫組。DAPI染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高溫組細(xì)胞凋亡率從高溫后6h開始顯著升高，持續(xù)至48h；而6mM和10mM牛磺酸組從高溫后12h開始明顯抑

10、制細(xì)胞凋亡，一直持續(xù)至48h。Caspase-3染色結(jié)果顯示，高溫組Caspase-3陽性率從高溫后6h開始顯著升高，持續(xù)至48h；6mM和10mM牛磺酸組Caspase-3陽性率于高溫后12h開始明顯低于高溫組，一直持續(xù)至48h。這一規(guī)律與DAPI檢測到的細(xì)胞凋亡率的變化基本一致。 4.?；撬釋Ω邷睾笊窠?jīng)上皮細(xì)胞分化的影響 倒置相差顯微鏡下，正常對照組細(xì)胞數(shù)量多，呈神經(jīng)元樣或膠質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞有細(xì)長的突起且互相連接成

11、網(wǎng)。高溫組細(xì)胞數(shù)量少，突起短，網(wǎng)絡(luò)稀疏。6mM和10mM?；撬岜Ｗo(hù)組細(xì)胞數(shù)量較多，生長狀態(tài)良好，細(xì)胞突起較高溫組長。免疫熒光結(jié)果顯示，正常對照組細(xì)胞MAP-2陽性率為37.74％；高溫組MAP-2陽性率為29.68％，與正常對照組相比，差異有顯著性（P<0.01）；6mM和10mM牛磺酸保護(hù)組細(xì)胞MAP-2陽性率分別為34.37％和34.90％，均明顯高于高溫組（P<0.01），與正常對照組相比，無顯著性差異。四組細(xì)胞的GFAP陽性率相

12、比，差異無顯著性。 結(jié)論： 分析實(shí)驗結(jié)果，我們得出以下結(jié)論： 1.高溫可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的神經(jīng)上皮細(xì)胞活性降低，并促使神經(jīng)上皮細(xì)胞凋亡。細(xì)胞子40℃條件下培養(yǎng)30min是研究高溫致神經(jīng)上皮細(xì)胞凋亡的適宜條件。 2.一定濃度范圍（6mM～10mM）的?；撬崛芤嚎擅黠@增強(qiáng)高溫后神經(jīng)上皮細(xì)胞的增殖活性，并減少高溫所致神經(jīng)上皮細(xì)胞的過度凋亡。其對凋亡的抑制作用可能與降低細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。 3