基于UPLC-Q-TOF MS及AFLP技術(shù)輔助遠志良種選育研究.pdf

1、遠志作為我國常用大宗藥材之一，具有安神益智，交通心腎，祛痰，消腫等功效。目前，遠志栽培品種混亂，新品種的選育主要參考農(nóng)作物的選育標準，以產(chǎn)量，種植年限以及表觀農(nóng)藝性狀為主要選育指標。作為一種中藥材，應以藥效作為其質(zhì)量的衡量指標，而藥效的物質(zhì)基礎為化學成分。由于化學成分的多少不可直接觀察，因此，我們有必要建立遠志農(nóng)藝性狀與化學成分含量的相關(guān)性分析，并從DNA分子水平初步探討遺傳差異與農(nóng)藝性狀間的關(guān)系，闡述其遺傳多樣性，進而輔助指導育種工作

2、。
　　目的：探究遠志化學指標成分與農(nóng)藝性狀的關(guān)系，明確提出傳統(tǒng)新品種選育指標；找出不同農(nóng)藝性狀對應的差異代謝物，為定向育種提供一種研究思路；篩選出在遠志中擴增多態(tài)性好的引物，并對多態(tài)性條帶與農(nóng)藝性狀進行關(guān)聯(lián)分析，闡述其遺傳背景。
　　方法：測定18份遠志樣品的農(nóng)藝性狀；采用高效液相色譜-紫外檢測器（High Performance Liquid chromatography-Ultraviolet，HPLC-UV）技術(shù)測定

3、遠志中細葉遠志皂苷、口山酮Ⅲ和3,6′-二芥子?；崽堑暮浚焕贸咝б合嗌V-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（ Ultra high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC/Q-TOF MS）代謝組學技術(shù)，分析不同農(nóng)藝性狀的差異代謝物；基于擴增片段長度多態(tài)性（ Amplified fragment length pol

4、ymorphism，AFLP）分子標記技術(shù)篩選出在遠志中擴增多態(tài)性好的引物，并分析18份遠志樣品的多態(tài)性條帶。
　　結(jié)果：⑴遠志的株高、直徑、根長、根分叉高度、側(cè)根數(shù)及根重六個農(nóng)藝性狀均存在不同程度的遺傳變異，其中農(nóng)藝性狀株高、根分叉高度、側(cè)根數(shù)、根重的變異程度較大且存在顯著性差異。通過農(nóng)藝性狀間的相關(guān)性分析可知，直徑與根重的相關(guān)性最大。⑵細葉遠志皂苷、口山酮Ⅲ和3,6′-二芥子酰基蔗糖含量均達到2010版《中國藥典》規(guī)定的遠志樣

5、品有1號、3號、4號、7號、8號、9號、13號、14號、15號和17號。細葉遠志皂苷的含量與六個農(nóng)藝性狀指標無明顯的相關(guān)性；3,6′-二芥子酰基蔗糖在根較長的遠志樣品中的含量較高；而口山酮Ⅲ在根較短、根分叉高度較矮，側(cè)根數(shù)多的樣品中含量較高。⑶從遠志樣品的 UPLC/Q-TOF MS圖譜中共推斷指認29個化合物。采用UPLC/Q-TOF MS代謝組學技術(shù)，分別找到了與六個農(nóng)藝性狀相關(guān)的差異代謝物，其中對六個農(nóng)藝性狀分類貢獻較大的差異代謝

6、物主要集中在 Sibiricoses A6、Tenuifoliside B、Tenuifoliside A、PolygalaxanthoneⅢ、Tenuifoliose B、Tenuifoliose A、Polyga lasapo nin xxⅧ這7個化合物中，說明這些化合物與遠志農(nóng)藝性狀的表達密切相關(guān)。通過分析6對相關(guān)農(nóng)藝性狀的共有差異代謝物發(fā)現(xiàn)，呈正相關(guān)農(nóng)藝性狀的共有差異代謝物在兩農(nóng)藝性狀中的變化趨勢相同，呈負相關(guān)農(nóng)藝性狀的共有差異

7、代謝物在兩農(nóng)藝性狀中的變化趨勢相反。⑷基于AFLP分子標記技術(shù)共篩選出在遠志中擴增多態(tài)性好的12對引物，對18份遠志樣品進行實驗，共擴增出184個條帶，多態(tài)性條帶比率為94.57％?；趩我蛩胤讲罘治龇ǎY選了與六個農(nóng)藝性狀顯著相關(guān)的20個多態(tài)性條帶。通過AFLP分子標記發(fā)現(xiàn)，一個基因可同時與多個性狀相關(guān)，而一個性狀也可能受多個基因的共同調(diào)節(jié)。18份遠志樣品的多態(tài)性條帶聚類結(jié)果與遺傳一致度及遺傳距離的分析結(jié)果相一致。遠志樣品的農(nóng)藝性狀聚

8、類、液質(zhì)數(shù)據(jù)聚類、多態(tài)性條帶聚類均將樣品分為三大類，但又不完全一致。通過對遠志中化合物與多態(tài)性條帶的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，單個化合物的合成可能受多個基因的調(diào)節(jié)，而一個基因也可能同時調(diào)節(jié)多個化合物的合成路徑，符合生物系統(tǒng)的復雜性。
　　結(jié)論：對于遠志品種選育來講，只有結(jié)合化學成分與農(nóng)藝性狀兩個指標才能更加準確的指導育種。若遠志樣品是用作中藥制劑的原料，應著重選育4號、13號樣品；若遠志樣品是用作中藥飲片的生產(chǎn)，應著重選育1號、9號樣品。通過