基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)的連花清瘟膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、中藥是在傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下應(yīng)用的天然藥物，連花清瘟膠囊2004年被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）批準(zhǔn)上市，并于2009年被衛(wèi)生部推薦用于治療甲型H1N1流感。近年來(lái)的臨床研究顯示連花清瘟膠囊具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)功能，并能抑制慢性阻塞性肺病急性發(fā)作期的氣管炎癥。在治療甲型流感病毒感染改善癥狀方面優(yōu)于達(dá)菲。目前在臨床、藥理研究方面已進(jìn)行了較為深入的研究，但連花清瘟膠囊體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確。
　　UPLC-MS/Q-TOF–MS是

2、快速而有效的復(fù)雜樣品分析技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)擬在多組分分析、藥代動(dòng)力學(xué)及排泄動(dòng)力學(xué)研究的基礎(chǔ)上，分析連花清瘟主要活性成分及可能的代謝產(chǎn)物和轉(zhuǎn)化途徑，為其藥理學(xué)研究提供依據(jù)。建立中藥復(fù)方多成分及其代謝物的 UPLC-MS-MS、UPLC-Q-TOF-MS分析平臺(tái)，完善連花清瘟多組分的體內(nèi)外分析方法。測(cè)定大鼠口服給藥后連花清瘟相關(guān)組分的血藥濃度，根據(jù)藥時(shí)曲線計(jì)算相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，研究連花清瘟在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)

3、。應(yīng)用 UPLC-Q-TOF-MS法進(jìn)行連花清瘟組分連翹苷在大鼠膽汁及尿液中代謝產(chǎn)物的研究，建立連翹苷的體外肝代謝模型，比較體內(nèi)和體外代謝差異，研究連翹苷不同種屬動(dòng)物與人類之間體外代謝差異，為連翹苷生物體內(nèi)過程的進(jìn)一步研究并闡明作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)測(cè)定大鼠尿液中8個(gè)主要活性成分，進(jìn)行連花清瘟膠囊大鼠體內(nèi)排泄研究，為連花清瘟膠囊的研發(fā)和藥物臨床應(yīng)用的安全性提供依據(jù)。
　　第一部分基于UPLC-M

4、S-MS技術(shù)的連花清瘟膠囊多組分同時(shí)分析
　　目的：建立一種UPLC-MS-MS方法同時(shí)測(cè)定連花清瘟膠囊中8個(gè)活性化合物的含量。
　　方法：取連花清瘟膠囊內(nèi)容物，研勻，精密稱定干膏粉約0.5g，置具塞錐形瓶中，加甲醇100mL，密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI源），正負(fù)離子切換掃描模式，毛細(xì)管噴霧電壓為3.5kV，脫溶劑氣溫度為

5、550℃。對(duì)每個(gè)化合物的CE和CV進(jìn)行優(yōu)化， ESI一級(jí)全掃描質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+和二級(jí)全掃描質(zhì)譜子離子分別為：大黃酚 m/z253.0?225.0；大黃素 m/z269.0?225.0；大黃酸 m/z283.0?239.0；蘆薈大黃素m/z269.0?240.0；甘草苷m/z417.0?255.0；木犀草素 m/z287.0?153.0；連翹苷 m/z578.8?370.8；紅景天苷 m/z299.0?119.0；駐留時(shí)間為0

6、.163secs。液相色譜條件：Waters ACQUITY UPLC? HSS T3 C18色譜柱（2.1×50 mm,1.8μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1％甲酸水（B），0.4 mL/min梯度洗脫，0~2.5 min，A15%-85%，2.5~4.5 min，A85%~15%；每次進(jìn)樣前以流動(dòng)相初始條件A15%預(yù)平衡3min；流速400μL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量8μL。
　　結(jié)果：8種化合物在測(cè)定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系

7、良好，r2>0.99；精密度RSD值小于1.73%，表明方法的精密度良好。平均回收率為92.8%~101.8%，RSD值為1.09%~3.79%；供試品溶液在室溫條件下放置12h穩(wěn)定性良好，RSD值小于2.83%。采用UPLC-MS-MS方法正負(fù)離子切換掃描7.5min完成一個(gè)分析周期。
　　結(jié)論：方法快速簡(jiǎn)便，靈敏度高，選擇性好，可用于連花清瘟膠囊質(zhì)量控制。
　　第二部分基于 UPLC-MS-MS技術(shù)的連花清瘟膠囊在大鼠體

8、內(nèi)的藥動(dòng)力學(xué)特征
　　目的：建立同時(shí)測(cè)定大鼠體內(nèi)連花清瘟膠囊組分大黃酸、大黃酚、連翹苷和紅景天苷UPLC-MS-MS方法，通過測(cè)定大鼠體內(nèi)血藥濃度建立藥-時(shí)曲線，計(jì)算藥動(dòng)力學(xué)參數(shù)，闡明其藥動(dòng)力學(xué)特征。
　　方法：雄性SD大鼠以8.5g/kg劑量灌胃給予連花清瘟混懸溶液，分別于給藥前及給藥后0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、360、420、480、600min，眼眥靜脈叢取血，置肝素

9、化抗凝管中，3500rpm離心10min，取上清液-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。血樣樣品處理采用液液萃取法，?.4mL血漿中依次加入5μL內(nèi)標(biāo)溶液（5μg/mL氯霉素的甲醇溶液），混勻，加入 HCl（1moL/L）10μL，混勻，加乙酸乙酯1.5mL，渦流混合2min，離心（16000 rpm）10min后，取乙酸乙酯1.5mL，N2吹干，殘留物加甲醇100μL，渦旋1min，離心（16000 rpm）10min，0.22μm濾頭過濾進(jìn)行UPLC

10、/MS/MS分析。液相色譜條件：Waters ACQUITY UPLC? HSS T3 C18色譜柱（2.1×50 mm,1.8μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫，0~2.5 min，A15%-85%，2.5~4.5 min，A85%~15%；流速400μL/min；柱溫40℃。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI源），負(fù)離子模式，毛細(xì)管噴霧電壓為3.5kV，脫溶劑氣溫度為550℃。測(cè)得樣品中大黃酸、大黃酚、連翹苷和紅

11、景天苷與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得血漿中各成分的濃度，獲得血藥濃度-時(shí)間曲線。藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)處理采用DAS3.0軟件。
　　結(jié)果：大鼠灌胃給予連花清瘟后，血漿中大黃酸、大黃酚、連翹苷、紅景天苷的Cmax分別為：1.813、0.336、0.622、0.579μg/mL；Tmax分別為：1.6、2.3、1.0、2.4h；t1/2分別為：2.213、3.165、1.512、4.13h；AUC0-t分別為：4.36、1.54、1.

12、106、3.229μg/mL·h2；AUC0-∞分別為：4.843、1.74、1.202、4.313μg/mL·h2；MRT分別為：3.152、3.37、1.574、4.233h。
　　結(jié)論：首次對(duì)連花清瘟膠囊中大黃酸、大黃酚、連翹苷和紅景天苷的藥代動(dòng)力學(xué)特征及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究連花清瘟膠囊藥理藥效提供依據(jù)。
　　第三部分基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)的連翹苷在大鼠膽汁、尿液及糞便中的代謝研究
　　

13、目的：建立大鼠體內(nèi)膽汁、尿液中連翹苷定性分析的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法，研究大鼠灌胃給予連翹苷后，連翹苷在大鼠體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化，并鑒定其相應(yīng)的代謝產(chǎn)物。
　　方法：大鼠以10mg·kg-1劑量灌胃給予連翹苷混懸溶液，生物樣品采用液液萃取法加入2倍量（v/v）乙酸乙酯萃取3次。Phenomenex Kinetex C18色譜柱（100×2.1mm，2.6μm），流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫，0~1 m

14、in，A5%，1~10 min，A5-50%，10~11 min，A50%~70%，11~15 min，A70%-100%，15~15.5 min，A100%-5%，15.5~18 min，A5%。流速為400μL/min，柱溫50℃。電噴霧離子源（ESI源），正離子和負(fù)離子模式。參數(shù)設(shè)置為：噴霧電壓為（+）5.5kV，（-）4.5kV；離子源溫度為550℃；氣簾氣為25psi；霧化氣（gas1）和加熱氣（gas2）均為55Psi；母離

15、子掃描范圍m/z100-1200（滯留時(shí)間250ms），子離子掃描范圍m/z50-1200（滯留時(shí)間100ms）；CE分別為（+）45eV和（-）45eV；CES為15eV；DP分別為（+）60eV和（-）60eV。連翹苷及其代謝物通過智能信息關(guān)聯(lián)采集（IDA）的采集方法，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）以及多重質(zhì)量虧損（MMDF）觸發(fā) TOF-MS/MS，結(jié)合 MetabolitePilotTM代謝物鑒定軟件進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：采用

16、 UPLC-Q-TOF-MS法對(duì)大鼠體內(nèi)膽汁、尿液中連翹苷及其代謝物進(jìn)行定性分析，大鼠灌胃給予連翹苷后膽汁、尿液和糞便中共發(fā)現(xiàn)34個(gè)代謝物，包括30個(gè)I相代謝物和4個(gè)II相代謝物，其中28個(gè)為新的代謝物。UPLC-Q-TOF-MS方法分析大鼠膽汁樣品發(fā)現(xiàn)連翹苷可轉(zhuǎn)化為主要代謝物M26，即經(jīng)脫葡萄糖基團(tuán)、脫水（-H2O）。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)首次采用 UPLC-Q-TOF-MS法對(duì)連翹苷在大鼠體內(nèi)代謝途徑進(jìn)行研究，連翹苷主要的生物轉(zhuǎn)化

17、路徑為水解、氧化和硫酸化。葡萄糖基團(tuán)、甲基基團(tuán)和四氫呋喃環(huán)是主要的代謝位點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)提高了對(duì)連翹苷代謝及有效形式的認(rèn)識(shí)。
　　第四部分連花清瘟膠囊中指標(biāo)性成分連翹苷體外代謝種屬差異研究
　　目的：采用 UPLC-Q-TOF-MS對(duì)大鼠和人肝微粒體體外溫孵樣品進(jìn)行分析，初步探究連翹苷體外代謝種屬差異特征，并比較體內(nèi)與體外代謝的異同。
　　方法：采用NADPH-生成系統(tǒng)（由β-NADP、G-6-P、G-6-PD、MgCl2

18、組成），0.1moL/LK2HPO4緩沖液（pH7.4），肝微粒體蛋白1mg/mL，終體積為1mL。將連翹苷與大鼠、人肝微粒體進(jìn)行體外溫孵，使底物濃度為25μg/mL，甲醇終濃度為0.5%，溫孵液37℃預(yù)熱5min后，向反應(yīng)體系中加入NADPH還原系統(tǒng)啟動(dòng)反應(yīng)。37℃恒溫振蕩（150r/min）1h，將反應(yīng)體系取出，立即放入-20℃冰箱終止反應(yīng)，每個(gè)樣品平行溫孵3次。樣品處理采用液液萃取法，分別加入乙酸乙酯3mL萃取兩次。合并有機(jī)相40

19、℃N2吹干，殘留物用甲醇200μL超聲5min復(fù)溶后離心（14000r/min）10 min，進(jìn)樣分析。應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)生物樣品進(jìn)行分析，結(jié)合前期體內(nèi)研究中已經(jīng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證的代謝產(chǎn)物，通過比較保留時(shí)間和二級(jí)質(zhì)譜碎片信息推測(cè)所測(cè)得代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：通過與空白樣品比較，在大鼠、人肝微粒體檢測(cè)并鑒定了16個(gè)不同結(jié)構(gòu)代謝物。檢測(cè)到6個(gè)代謝物與大鼠膽汁中檢測(cè)到的代謝物一致，其余10個(gè)為體外發(fā)現(xiàn)新的代謝物。連翹苷

20、大鼠、人肝微粒體溫孵樣品代謝途徑主要包括水解、氧化、脫甲基反應(yīng)。相似性指數(shù)（SI=0.952）表明連翹苷在大鼠和人肝微粒體中代謝非常相似。結(jié)果表明UPLC-Q-TOF-MS法結(jié)合累積分布函數(shù)（CDF）是評(píng)價(jià)連翹苷代謝種屬差異有效的方法。
　　結(jié)論：連翹苷體外肝微粒代謝研究表明兩個(gè)種屬的Ⅰ相代謝產(chǎn)物相似，大鼠與人幾乎無(wú)種屬差異。本研究提供了連翹苷全面的體內(nèi)和體外代謝譜，并可用于預(yù)測(cè)人體代謝研究。
　　第五部分基于 UPLC-M

21、S-MS技術(shù)的連花清瘟膠囊在大鼠體內(nèi)的排泄研究
　　目的：建立大鼠膽汁、尿液中大黃酚、大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、甘草苷、連翹苷、木犀草素、紅景天苷定量分析的UPLC-MS-MS方法，研究經(jīng)膽汁和尿液排泄動(dòng)力學(xué)過程，探討其在大鼠體內(nèi)的排泄動(dòng)力學(xué)規(guī)律，為連花清瘟膠囊的研發(fā)和藥物臨床應(yīng)用的安全性提供依據(jù)。
　　方法：大鼠2%戊巴比妥鈉麻醉后行膽管插管術(shù)，待動(dòng)物完全清醒后給予連花清瘟混懸液。分別于0-2、2-4、4-6、6-8、8

22、-10、10-24、24-36h收集膽汁樣品。大鼠給藥后0-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-12、12-36h收集尿液樣品。樣品預(yù)處理采用一步沉淀蛋白法。采用 Waters ACQUITY UPLC? HSS T3 C18色譜柱（2.1×50 mm,1.8μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫，0~2.5 min，A15%-85%，2.5~4.5 min，A85%~15%，4.5~7.5min，A15%，

23、流速為400μL/min，電噴霧離子源（ESI源），正/負(fù)離子模式。
　　結(jié)果：采用ESI離子源，MRM正/負(fù)離子切換掃描模式完成檢測(cè)和定量分析。對(duì)定量方法進(jìn)行優(yōu)化整個(gè)運(yùn)行時(shí)間為7.5min。完整的定量方法學(xué)驗(yàn)證顯示方法的線性和專屬性良好。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示該方法簡(jiǎn)單、快速、專屬性強(qiáng)。大鼠灌胃給予連花清瘟混懸液后8個(gè)待測(cè)化合物均可在大鼠尿液中檢測(cè)到，膽汁中可檢測(cè)到5個(gè)待測(cè)化合物。8個(gè)待測(cè)物在尿液中12h內(nèi)累計(jì)排泄量達(dá)到最大值，之后