基于UPLC Q-TOF MS技術(shù)的四物湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)深入研究.pdf

1、中藥復(fù)方在傳統(tǒng)分離分析研究過(guò)程中利用的HPLC、HPTLC等技術(shù),分析工作量大,速度慢,對(duì)對(duì)照品依賴度很高,能夠發(fā)現(xiàn)的四物湯中的化學(xué)成分也較少,而現(xiàn)今出現(xiàn)UPLC、LC-MS等技術(shù),分析速度大幅提高,勞動(dòng)強(qiáng)度明顯減小,在沒有對(duì)照品的情況下也能發(fā)現(xiàn)較多的四物湯化學(xué)成分。本文采用新技術(shù)更加科學(xué)深入地認(rèn)識(shí)四物湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及配伍變化,為指導(dǎo)臨床正確使用該類藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:運(yùn)用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC

2、-TOF MS)技術(shù)平臺(tái)和計(jì)算機(jī)輔助技術(shù),深入認(rèn)識(shí)四物湯水煎液的化學(xué)組成及其配伍變化。在研究四物湯復(fù)方的基礎(chǔ)上提出了中藥配對(duì)比較的研究思路,采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)對(duì)市場(chǎng)上正規(guī)銷售的赤芍和白芍飲片、當(dāng)歸和川芎飲片進(jìn)行比較,了解中藥赤芍和白芍煎液、當(dāng)歸和川芎煎液的化學(xué)成分差異。通過(guò)對(duì)兩組藥對(duì)物質(zhì)基礎(chǔ)研究可以間接考察藥理作用差異,進(jìn)而為揭示藥效差異的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:本研究主要利用UPLC-Q/TOF-MS技術(shù),并

3、在這個(gè)平臺(tái)的基礎(chǔ)上,提供相應(yīng)的幾種改進(jìn)方法,對(duì)四物湯的化學(xué)成分進(jìn)行深入研究。首先通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)以及使用Formular analyzer插件創(chuàng)建四物湯四種單藥所在屬際(包括地黃屬、當(dāng)歸屬、白芍屬、藁本屬)植物化合物文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù),建立四物湯的化學(xué)指紋圖譜,利用Masslynx4.1軟件獲取data-set中的數(shù)據(jù)保存至Excel表中,通過(guò)四物湯以及四組單藥的樣品組與空白組比較,實(shí)現(xiàn)信號(hào)濾噪。用自制自動(dòng)化預(yù)鑒別Searcher軟件與自建四物

4、湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)化比對(duì),并用自制Sourcer程序分析四物湯信號(hào)的單藥來(lái)源,實(shí)現(xiàn)化學(xué)成分快速鑒別。用t檢驗(yàn)p值排序法尋找四物湯藥味共煎煮過(guò)程中含量發(fā)生變化的化學(xué)成分。利用UPLC/Q-TOFMS技術(shù)建立白芍、赤芍兩味單藥水煎液的化學(xué)指紋圖譜并與芍藥屬數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用MassLynx4.1軟件中主成分分析和正交偏最小二乘辨別分析。成分鑒別采用與標(biāo)準(zhǔn)品比較,基于自制自動(dòng)化預(yù)鑒別軟件和芍藥屬質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的一級(jí)質(zhì)譜精確

5、質(zhì)荷比分析,二級(jí)質(zhì)譜碎片分析。當(dāng)歸、川芎兩味單藥水煎液采用同樣的研究方法,利用自制自動(dòng)化預(yù)鑒別軟件,通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)荷比信息,將統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)與自主研發(fā)當(dāng)歸、川芎兩藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配。得到初步結(jié)果后再與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行驗(yàn)證分析。
　　結(jié)果:本文建立了四物湯單藥屬際化學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù),包含文獻(xiàn)化合物分子式、化學(xué)名等信息共1000余項(xiàng),從四物湯水煎液中與四物湯化學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配后快速鑒別信號(hào)達(dá)187個(gè),其中根據(jù)信號(hào)的質(zhì)荷比鑒別出19種存在

6、多離子證據(jù)的化學(xué)成分。四物湯共煎煮后大多數(shù)成分較單獨(dú)煎煮有減少的趨勢(shì),只有極少數(shù)成分在單煎液中沒有信號(hào)或信號(hào)很弱,而在共煎液中信號(hào)明顯,在正、負(fù)離子模式下各有3個(gè)信號(hào)上調(diào)趨勢(shì)明顯,推測(cè)共煎煮過(guò)程中可能只有極少量新生成的化學(xué)成分或藥味固有成分煎出大幅增加。氧化芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷分別是赤芍和白芍水煎液中貢獻(xiàn)度最大的兩種差異性化合物。此外,赤芍藥苷、1’-O-benzoylsucrose、牡丹皮苷F、牡丹皮苷C/苯甲酰羥基芍藥苷、牡丹皮苷E、

7、(1S,2S,4R)-trans-2-hydroxy-1,8-cineole-β-D-glucopyranoside、蔗糖、沒食子酰芍藥苷/沒食子酰芍藥內(nèi)酯苷等可能也在赤芍、白芍煎液中含量差異明顯。從當(dāng)歸、川芎水煎液中快速鑒別信號(hào)121個(gè),得到初步結(jié)果后再進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品比較驗(yàn)證分析,結(jié)果表明三糖類化合物和含有丁烯基苯酞結(jié)構(gòu)的未知化合物可能是當(dāng)歸和川芎煎液的主要差異化學(xué)標(biāo)記物。
　　結(jié)論:本研究探討了在共煎煮過(guò)程中四物湯化學(xué)成分的變化,