尿酸激活AMPK和ERK信號途徑誘導大鼠胰島β細胞的氧化損傷和增殖抑制.pdf

1、背景：
　　高尿酸血癥是嘌呤代謝紊亂引起的一種代謝性疾病，隨著我國人民生活水平的提高，高尿酸血癥的患病率也顯著升高。研究表明，高尿酸水平不僅和痛風的發(fā)病密切相關(guān)，也和體內(nèi)多種代謝紊亂疾病如代謝綜合癥、高血壓、冠心病以及腎臟疾病等存在關(guān)聯(lián)。此外，高尿酸血癥常與糖代謝異常尤其是胰島素抵抗并發(fā)，但其相互關(guān)系及內(nèi)在機制不甚明了。已有研究表明，高尿酸血癥可以直接參與糖脂代謝紊亂、內(nèi)皮細胞損傷、腎損傷、炎癥等重要病理生理過程。高尿酸可增加脂肪

2、細胞、血管平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞及腎小球系膜細胞的氧化壓力，并激活促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases， MAPK)家族的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)信號途徑。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是細胞內(nèi)能量代謝的―感受器‖， AMPK可以調(diào)節(jié)細胞的糖

3、脂代謝、蛋白質(zhì)合成以及細胞的增殖。AMPK和ERK信號是否參與了高尿酸對胰島β細胞的直接作用尚未見闡述。高尿酸是否直接作用于胰島β細胞及對糖代謝紊亂的影響和分子機制需進一步研究。
　　目的：
　　本研究將通過調(diào)查高尿酸對大鼠胰島β細胞的氧化損傷、AMPK和ERK分子信號途徑及細胞增殖的影響，探討高尿酸對胰島β細胞的直接作用及其分子機制。為高尿酸血癥及相關(guān)的糖代謝紊亂的病理生理學提供新的理論。
　　方法：
　　1.

4、用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠胰島β細胞株INS-1和RIN-m5F細胞。
　　2.用不同濃度（0、5、7.5、10、15mg/dl）尿酸作用INS-1和RIN-m5F細胞24、48、72小時，或用ERK抑制劑PD98059預處理細胞30分鐘，噻唑藍比色法(MTT法)檢測細胞存活率。
　　3.使用15mg/dl尿酸作用INS-1和RIN-m5F細胞24h后，再

5、用2’,7-二氫二氯熒光素(2',7'-dichlorofluorescein-diacetate，DCFH-DA)探針37℃下作用細胞30分鐘，倒置熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平。
　　4.用不同濃度（0、5、10、15mg/dl）尿酸作用INS-1和RIN-m5F細胞30分鐘，或使用抗氧化劑NAC和DPI、AMPK抑制劑Compound C、ERK抑制劑PD

6、98059或有機陰離子轉(zhuǎn)運體(Organic anion transporter，OAT)抑制劑丙磺預舒處理細胞30分鐘，蛋白免疫印跡（Western Blot）方法檢測細胞AMPK和ERK磷酸化水平。
　　5.提取 INS-1，RIN-m5F細胞和大鼠腎臟組織總 RNA，RT-PCR檢測尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1(Urate transporter1，URAT1)的mRNA表達。
　　結(jié)果：
　　1.高尿酸可以抑制大鼠胰島β細

7、胞的增殖，且此抑制作用呈時間和濃度依賴性。
　　2.高尿酸能顯著增加大鼠胰島β細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。
　　3.高尿酸能夠激活大鼠胰島β細胞的AMPK和ERK信號途徑。
　　4.高尿酸誘導的大鼠胰島β細胞AMPK和ERK磷酸化作用可被抗氧化劑NAC和DPI阻滯；ERK磷酸化作用可被AMPK抑制劑Compound C阻滯；細胞增殖抑制作用可被ERK抑制劑PD98059阻滯。
　　5.大鼠胰島β細胞不表達URAT1 mR