缺氧人視網膜色素上皮細胞株ARPE-19差異MicroRNA表達及鑒定.pdf

1、第一部分:缺氧人視網膜色素上皮細胞株ARPE-19表達特性
　　 目的:觀察缺氧對人視網膜色素上皮株ARPE-19的細胞形態(tài)、增殖以及對其分泌的血管內皮生長因子和色素上皮衍生因子表達的影響。
　　 方法:將ARPE-19細胞分別置正常和缺氧環(huán)境中培養(yǎng)0hr、8hr、24hr、48hr后，MTT比色法檢測ARPE-19細胞的增殖；Hochest染色觀察細胞形態(tài)、檢測細胞凋亡率；流式細胞儀檢測細胞凋亡率；選取缺氧24hr的細

2、胞，RT-PCR檢測VEGF mRNA及PEDF mRNA的表達，經計算機圖像處理，定量分析。
　　 結果:缺氧組的MTT實驗吸光度(A值)明顯低于正常組，缺氧48小時時差異最顯著(P<0.001)；Hochest染色及流式細胞儀檢測細胞凋亡率，缺氧24小時時其凋亡率明顯高于正常組(P<0.001)；RT-PCR檢測VEGF mRNA表達缺氧組明顯高于正常組，PEDF mRNA表達缺氧組明顯低于正常組。
　　 結論:缺氧

3、可加劇ARPE-19細胞的凋亡，破壞VEGF與PEDF表達的平衡，調節(jié)視網膜色素上皮細胞的活性是抑制脈絡膜新生血管生成的關鍵。
　　 第二部分:缺氧人視網膜色素上皮細胞株ARPE-19 MicroRNA的差異表達
　　 目的: MicroRNA在調控基因表達及組織功能等方面發(fā)揮著重要的作用。但對其在眼科領域對于CNV的形成的調控卻研究的很少。本部分目的在于篩選CNV形成相關的MicroRNA。
　　 方法:視網膜

4、色素上皮細胞株ARPE-19置缺氧環(huán)境24小時后，抽提RNA進行MicroRNA芯片(LC science公司)檢測。對于信號值高于1000的差異MicroRNA利用實時定量PCR(q-PCR)進行檢測。
　　 結果:具有顯著性差異(即p值<0.01)表達轉錄子共有42條miRNA，其中低氧后上調的18條，下調的24條，信號值差異位居前十位的MicroRNA分別為Mir-1、Mir-1469、Mir-663、Mir-1915、M

5、ir-29c、Mir-574-5p、Mir-638、Mir-29b-1、Mir-1308、Mir-10a，其中除Mir-1、Mir-29c、Mir-1308表現為下調外，其余均表現為上調。信號值高于1000的MicroRNA共有28條，其中Mir-638、Mir-1308、Mir-125b、Mir-155、Mir-30c、Mir-125a-5p與芯片檢測結果相一致，Mir-155表達異常最為顯著。
　　 結論:視網膜色素上皮細胞

6、株ARPE-19細胞經缺氧處理后，很多MicroRNA發(fā)生差異性表達，可能與CNV的形成密切相關。
　　 第三部分: MicroRNA-155轉染人視網膜色素上皮細胞株ARPE-19活性初步研究
　　 目的：探討對于視網膜色素上皮細胞株ARPE-19細胞，Mir-155是否具有一定的抗缺氧活性，并對CNV的形成具有一定的調節(jié)作用。
　　 方法：Mir-155轉染視網膜色素上皮細胞株ARPE-19細胞后，將其置缺氧

7、環(huán)境0hr，8hr、24hr、48hr后，MTT比色法檢測ARPE-19細胞的增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　 結果：轉染組的MTT實驗吸光度(A值)高于未轉染組，缺氧48小時時差異最明顯；流式細胞儀檢測細胞凋亡率，轉染組凋亡率低于未轉染組(P<0.001)，缺氧48小時時差異最明顯。
　　 結論：Mir-155轉染視網膜色素上皮細胞株ARPE-19細胞后，具有一定的抗缺氧活性，對CNV的形成具有一定的調節(jié)作用。<