獼猴溶組織內(nèi)阿米巴原蟲病病原分離鑒定及凝集素hgl基因的原核表達(dá).pdf

1、本研究從獼猴阿米巴病例的腹瀉糞樣中分離到一株阿米巴原蟲，該原蟲經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察后，初步鑒定為溶組織內(nèi)阿米巴或迪斯帕內(nèi)阿米巴，采用鑒別溶組織內(nèi)阿米巴和迪斯帕內(nèi)阿米巴的蟲種特異性引物，對(duì)阿米巴原蟲peroxiredoxin基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示溶組織內(nèi)阿米巴特異性引物擴(kuò)增出了相應(yīng)大小的DNA片斷，經(jīng)過(guò)克隆后測(cè)序，序列分析(登錄號(hào)為：EU022309)顯示本蟲株與人溶組織內(nèi)阿米巴株序列同源性為98％-99％，而與人迪斯帕內(nèi)阿

2、米巴株序列同源性僅為89％，鑒定該阿米巴獼猴分離株為溶組織內(nèi)阿米巴，命名為EntamoebahistolyticaMH530株。 參照GenBank中收錄的人溶組織內(nèi)阿米巴原蟲半乳糖/乙酰氨基半乳糖凝集素的重鏈hg1基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得與預(yù)期相符的產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)克隆后測(cè)序，得到1761bp的有效基因序列。通過(guò)對(duì)該基因核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果表明核苷酸序列與人溶組織內(nèi)阿米巴的序列同源性在93.44％-

3、96.21％之間，與人迪斯帕內(nèi)阿米巴的序列同源性為87.44％。該基因編碼了一個(gè)有587個(gè)AA的多肽，分子量為65.514KD，等電點(diǎn)理論值為5.17，具有較強(qiáng)的親水性，蛋白抗原性分析顯示其抗原位點(diǎn)分布于整個(gè)蛋白質(zhì)多肽鏈。該序列已登錄在GenBank上(登錄號(hào)為EU244479)。 根據(jù)獲得的基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)表達(dá)引物，對(duì)其中重要的含多個(gè)抗原決定簇的LC3段進(jìn)行原核表達(dá)，制備目的基因和表達(dá)載體，將目的片斷插入pET32b(+)表達(dá)