急性白血病MLL基因重排的檢測及臨床特點研究以及基因斷裂融合檢測新方法初探.pdf

1、目的： 1.研究急性白血病(acute leukemia，AL)中混合譜系白血病(mixed lineage leukemia.MLL)基因重排的多重巢式(multiplex nested)RT-PCR方法檢測，并探討其生物學和臨床特點。 2.研究AL中MLL基因重排在監(jiān)測微小殘留病(minimal residual disease，MRD)中的作用和意義。 3.建立一種檢測RAR0c、AML1及MLL等基因斷裂

2、融合的新的篩選方法。 方法： 1.MLL基因重排的檢測 1.1 對171例AML和76例ALL患者用Multiplex Nested RT-PCR方法進行MLL基因重排的檢測，選取轉(zhuǎn)錄因子E2A作為內(nèi)對照同步進行轉(zhuǎn)錄和擴增。檢測的MLL基因重排包括MLUA/AF4、MLL/AF6、MLL/AF9、MLL/AF10、MLL/AF17、MLL/FL、LMLL/ENL、MLL/AFX1、MLL/IP、MLL/1Q和ML

3、L-PTD等11種。 1.2 流式細胞技術采用活細胞三色熒光標記檢測的免疫表型。 1.3 對部分AL患者作染色體核型分析。 2.B/C比值法的建立 2.1 B區(qū)和C區(qū)引物設計在正常RARα、AML1和MLL的cDNA模板上，分別針對RARer、和MLL基因的斷裂點區(qū)B區(qū)(Breakpoints region)設計引物，上游引物和下游引物分別位于斷裂點區(qū)兩端，并在非斷裂位點區(qū)C區(qū)(Control regio

4、n)作為內(nèi)對照，分別設計引物C1和C2。 2.2 最佳線性循環(huán)擴增數(shù)的確定取正常對照cDNA，分別用RARα、AML1和MLL基因的B區(qū)和C區(qū)引物，根據(jù)各自的反應條件進行擴增，循環(huán)數(shù)依次為26、28、30、32、34、36。然后取擴增產(chǎn)物電泳，記錄條帶灰度值，并做出線性擴增曲線，確定最佳線性循環(huán)數(shù)。 2.3 確定反應所需的骨髓原始細胞最低比例NB4細胞系(PMIURARα陽性)和K562細胞系(PML/RARα陰性)按一

5、定比例混合(NB4細胞占細胞總數(shù)的O％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)共形成11組混合細胞，提取RNA后以RARα基因的擴增條件和循環(huán)數(shù)進行RT-PCR，從細胞系水平確定反應所需的最低原始細胞比例。 選取骨髓原始細胞比例為96.4％的PML/RARct融合基因陽性標本，按15％、30％、45％、60％、75％、90％原始細胞比例與正常對照混合，分別測定B/C值，從病例水平確定B

6、/C比值法要求的入選標本最低原始細胞比例。 2.4 B/C比值法準確性驗證選取30例已知PML/RARα陽性標本和正常對照各30例以B/C比值法檢測，計算B/C值，進行統(tǒng)計學分析； 常規(guī)RT-PCR方法檢測PML/RARα、AML1/ETO融合基因和MLL基因重排陽性者，分別作B/C比值法檢測，計算B/C值，與正常對照比較。 結(jié)論： 1.多重RT-PCR是臨床檢測MLL基因重排較為精確和靈敏的方法。

7、 2.在AML中MLL基因重排是FAB亞型M4和M5常見的基因改變，多見于WBC增高患者；ALL中MLL基因重排以MLL/AF4為主，多見于pro-B ALL。MLL基因重排的急性白血病AL患者CR率與陰性者無明顯差異，但預后較差。 3.MLL基因重排可作為MRD的監(jiān)測指標，在AL判斷復發(fā)和治療方案的個體化選擇及預后方面有重要意義。 4.B/C比值法是一種創(chuàng)新性的方法。實質(zhì)是一種半定量.PCR方法，是一種有效的判斷RA