眼附屬器黏膜相關(guān)淋巴瘤Bcl10基因的檢測(cè)及其新的突變的意義的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)研究通過檢測(cè)中國(guó)人群眼眶、結(jié)膜、淚腺、眼瞼部位的MALT淋巴瘤、不典型淋巴組織增生和淋巴組織反應(yīng)性增生中Bcl10基因的存在，對(duì)照國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，從中發(fā)現(xiàn)新的突變。觀察突變型Bel10基因蛋白表達(dá)及與激活NF-kappaB通路之間的關(guān)系，探討B(tài)cl10基因新的突變和突變型Bcl10基因在MALT淋巴瘤診斷方面的意義，為明確Bcl10基因激活NF-kappaB信號(hào)通路在MALT淋巴瘤發(fā)病機(jī)制中的作用提供新的依據(jù)。 一、目的：

2、 1．檢測(cè)Bcl10基因在眼眶、結(jié)膜、淚腺、眼瞼部位的MALT淋巴瘤、不典型淋巴組織增生、淋巴組織反應(yīng)性增生中的表達(dá)，探討其在臨床診斷中的意義。 2．觀察突變型Bcl10基因和NF-kappaB在MALT淋巴瘤、不典型淋巴組織增生、淋巴組織反應(yīng)性增生中的蛋白表達(dá)和核定位，考察兩者之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)突變型Bcl10蛋白的核表達(dá)對(duì)NF-kappaB信號(hào)通路的影響，推測(cè)Bcl10基因的突變所引起核表達(dá)導(dǎo)致NF-kappaB核轉(zhuǎn)位

3、在MALT淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制中可能存在的作用。 二、方法： 1.收集上海第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院眼科2005年～2006年間收治的病理診斷為眼附屬器MALT淋巴瘤患者23例，不典型淋巴組織增生患者10例，淋巴組織反應(yīng)性增生患者10例為陽(yáng)性組，正常外周淋巴結(jié)組織12例為陰性對(duì)照組。陽(yáng)性病例組以2001年WHO淋巴造血組織腫瘤分類為診斷標(biāo)準(zhǔn)，雙盲法經(jīng)兩位病理醫(yī)師篩選納入研究。其中23例MALT淋巴瘤患者，男性15例，女性8例，平均

4、發(fā)病年齡62.31±11.23歲(40歲～82歲)。10例不典型淋巴組織增生患者男性6例，女性4例，66.92±7.5歲(55歲～76歲)。10例淋巴組織反應(yīng)性增生患者，男性5例，女性5例，71.69±3.65歲(55歲～78歲)。所有病例均采用手術(shù)切除新鮮標(biāo)本。術(shù)后取標(biāo)本立即凍存于液氮中保存?zhèn)溆谩?2.應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)所有研究對(duì)象眼附屬器MALT淋巴瘤、不典型淋巴組織增生、淋巴組織反應(yīng)性增生中Bcl10基因的表達(dá)，雙脫氧

5、Sanger法行DNA測(cè)序，進(jìn)入GENBANK BLAST比對(duì)分析，對(duì)照國(guó)外報(bào)道序列，發(fā)現(xiàn)新的突變類型。 3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)(Envision法)和免疫熒光(間接法)檢測(cè)突變型Bcl10和NF-kappaB在所有研究對(duì)象中的蛋白表達(dá)。 4.應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡(Leica公司，TCS，SP2型)觀察Bel10和NF-kappaB表達(dá)的共定位。第1通道FITC(異硫氰酸熒光素)，最大吸收光譜488am，最大發(fā)射光譜520

6、nm，為二抗標(biāo)記鼠抗人Bel10抗體，為綠色熒光；第2通道Cyanine3，最大吸收光譜543nm，最大發(fā)射光譜570nm，二抗標(biāo)記NF-kappaBp65抗體，為紅色熒光。DAPI染核，紫外光發(fā)射光譜360nm。 5.數(shù)據(jù)用x±s表示。Bcl10基因的表達(dá)率、Bcl10基因的突變率在陽(yáng)性組和陰性組之間的比較采用x<'2>檢驗(yàn)，F(xiàn)isher確切概率法檢驗(yàn)分析。Bcl10核表達(dá)和Bcl10突變率之間的關(guān)系、Bcl10核表達(dá)和NF-

7、kappaB表達(dá)之間的關(guān)系，采用x<'2>檢驗(yàn)，F(xiàn)isher確切概率法檢驗(yàn)和spearman等級(jí)相關(guān)分析。所有結(jié)果采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，以P<0.05認(rèn)為差異有顯著性意義。 三、結(jié)果： 1.陽(yáng)性組43例研究對(duì)象中，21例(48.84％)檢出Bcl10基因的eDNA表達(dá)，比較國(guó)外報(bào)道突變序列，發(fā)現(xiàn)有新的突變12例(57.14％)。分別是外顯子294位核苷酸缺失129個(gè)堿基，導(dǎo)致編碼蛋白區(qū)由正常全長(zhǎng)233位

8、氨基酸截短為99位氨基酸：該突變序列我們已發(fā)布于GENBANK(EF189176)。4例出現(xiàn)的同一種突變?yōu)椋和怙@子638位核苷酸點(diǎn)突變G→A，導(dǎo)致編碼蛋白區(qū)第213位氨基酸甘氨酸突變?yōu)楣劝彼帷Ｍ怙@子308位核苷酸點(diǎn)突變T→C，導(dǎo)致編碼蛋白區(qū)第103位氨基酸頡氨酸突變?yōu)楸彼?；外顯子368位核苷酸點(diǎn)突變T→C，導(dǎo)致編碼蛋白區(qū)第123位氨基酸谷氨酸突變?yōu)楦拾彼幔和怙@子374位核苷酸點(diǎn)突變A→G，導(dǎo)致編碼蛋白區(qū)第125位氨基酸苯丙氨酸突變?yōu)榻z

9、氨酸：外顯子5位核苷酸點(diǎn)突變T→C，導(dǎo)致編碼蛋白區(qū)第2位氨基酸谷氨酸突變?yōu)楦拾彼?。外顯子412位核苷酸點(diǎn)突變T→C，導(dǎo)致編碼蛋白區(qū)第103位氨基酸頡氨酸突變?yōu)楸彼帷?例突變外顯子145位核苷酸點(diǎn)突變A→G國(guó)外已見報(bào)道。10例不典型淋巴組織增生中有4例檢出Bcl10基因的cDNA表達(dá)，有1例發(fā)現(xiàn)外顯子346位核苷酸缺失33個(gè)堿基，導(dǎo)致編碼蛋白區(qū)第116位氨基酸到126位氨基酸的改變，是為mRNA的不同剪輯體。此例國(guó)外已見報(bào)道。10例淋巴

10、組織反應(yīng)性增生中2例檢出Bc110基因的cDNA表達(dá)，1例檢出新的突變?yōu)橥怙@子638位核苷酸點(diǎn)突變G→A，與MALT淋巴瘤中出現(xiàn)4例同樣的突變相同。12例正常外周淋巴結(jié)組織未檢出Bcl10基因的表達(dá)。Bcl10基因的突變率在陽(yáng)性組和陰性組之間差異有顯著性(P<0.05)。Bcl10基因的突變率在不同的惡性程度組中差異有顯著性(P<0.05)。Bcl10基因突變?cè)诓煌l(fā)病部位之間、不同臨床分期之間的差異不具有顯著性(P>0.05)。

11、 2．陽(yáng)性組中23例MALT淋巴瘤中，Bcl10蛋白在20例MALT淋巴瘤石蠟標(biāo)本中表達(dá)(86.96％)，其中胞核和胞漿同時(shí)表達(dá)13例(65.0％)；胞漿表達(dá)7例(35.0％)，陰性3例(13％)。10例不典型淋巴組織增生中，5例(50％)胞漿彌漫表達(dá)Bcl10。10例淋巴組織反應(yīng)性增生中，1例(10％)胞核和胞漿同時(shí)表達(dá)Bcl10，3例(30％)胞漿表達(dá)Bcl10。陰性組12例正常淋巴結(jié)中不表達(dá)。Bcl10蛋白的核表達(dá)和Bcl10基

12、因突變之間差異有顯著性(P<0.05)，兩者之間具有相關(guān)性(P<0.05)。Bcl10蛋白的核表達(dá)在不同的惡性程度組之間差異無顯著性(P>0.05)。 陽(yáng)性組23例MAIT淋巴瘤中，18例胞核和胞漿同時(shí)表達(dá)NF-kappaB(78.3％)，胞漿表達(dá)5例(21.7％)。10例不典型淋巴組織增生中，7例(70％)胞漿彌漫表達(dá)NF-kappaB。10例淋巴組織反應(yīng)性增生中，1例(10％)胞核和胞漿同時(shí)表達(dá)NF-kappaB，5例(50

13、％)胞漿表達(dá)NF-kappaB。陰性組12例正常淋巴結(jié)中均在胞漿表達(dá)NF-kappaB。 NF-kappaB蛋白在眼附屬器MALT淋巴瘤、不典型淋巴組織增生、淋巴組織反應(yīng)性增生中的陽(yáng)性率表達(dá)差異有顯著性(P<0.05)。Bcl10蛋白的核表達(dá)和NF-kappaB表達(dá)的差異有顯著性(P<0.05)，兩者之間具有相關(guān)性(P<0.05)。 3．激光共聚焦顯微鏡斷層掃描的信息用SFP選項(xiàng)進(jìn)行彩色三維重建后，可見用FITC標(biāo)記的Bcl10

14、蛋白呈現(xiàn)點(diǎn)狀或簇狀綠色熒光顆粒分布于細(xì)胞核和胞質(zhì)。用Cy3標(biāo)記的NF-kappaB蛋白呈現(xiàn)彌漫紅色熒光廣泛分布于胞質(zhì)。重建圖像后，可見黃色熒光為Bcl10和NF-kappaB共定位，其中Bcl10和NF-kappaB共表達(dá)有13例。Bcl10和NF-kappaB的共定位表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。 四、結(jié)論： 1．Bcl10基因在中國(guó)人群眼眶、結(jié)膜、淚腺、眼瞼部位的MALT淋巴瘤、不典型淋巴組織增生、淋巴組織反應(yīng)性增生

15、中有新的突變形式，共發(fā)現(xiàn)了12例新的突變，國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。2例突變與國(guó)外報(bào)道相同。其中以第213位氨基酸甘氨酸突變?yōu)楣劝彼?GGA→GAA)為主要新的突變形式；其次為截?cái)嘈屯蛔兗从葿cl10的CARD結(jié)構(gòu)域至C端截?cái)?，是為全長(zhǎng)233位氨基酸截?cái)酁?9位氨基酸。該突變序列我們已發(fā)布于GENBANK(EF189176)。 2．本研究在不典型淋巴組織增生和淋巴組織反應(yīng)性增生中發(fā)現(xiàn)了新的突變證明Bel10基因突變的檢測(cè)靈敏于病理診斷，能

16、在尚沒有形態(tài)學(xué)改變及其他可鑒別指標(biāo)下，判斷出病變階段和性質(zhì)的改變，能對(duì)患者提供準(zhǔn)確和及時(shí)的早期診斷，避免誤診和漏診，為取得滿意的療效提供機(jī)會(huì)。 3．突變型Bel10基因與腫瘤的惡性程度有關(guān)，其蛋白見于核表達(dá)，并與NF-kappaB胞核共定位表達(dá)呈正相關(guān)，此結(jié)果與Bcl10核轉(zhuǎn)位激活NF-kappaB轉(zhuǎn)錄入核引起細(xì)胞凋亡改變的理論是一致的，可作為早期診斷MALT淋巴瘤的靈敏指標(biāo)。通過對(duì)Bcl10基因突變的檢測(cè)，為明確Bel10激活