樹突狀細胞抗原交叉遞呈相關Rab分子的篩選及Rab3b，3c，32參與抗原交叉遞呈的機制研究.pdf

1、研究表明:抗原呈遞細胞(antigen presentation cell,APC)在呈遞和處理外源性抗原和內源性抗原時存在不同的途徑即MHC-Ⅰ類分子(Major Histocompatibility Complex classⅠ)途徑和MHC-Ⅱ類分子(Major Histocompatibility Complex classИ)途徑。經典的MHC-Ⅰ類途徑認為內源性合成蛋白在胞漿降解后,轉運到內質網與MHC-Ⅰ類分子結合形成復合

2、物后轉運的細胞膜上,活化CD8+T細胞;而外源性抗原被APC細胞內化后,與MHC-Ⅱ類分子結合形成MHC-Ⅱ類分子肽復合物,轉運到細胞膜上,活化CD4+T細胞。然而這兩條途徑并非完全的分離,事實上,外源性抗原同樣也可以進入MHC-Ⅰ類分子處理途徑,這種現象被稱為交叉呈遞(cross presentation)。最初Bevan等人在1976年發(fā)現抗移植物的免疫應答過程中存在此抗原遞呈途徑,到90年代Sigal等人在Science報道:在生

3、理情況下,此抗原途徑在機體抗病毒免疫應答中起著重要作用。隨后越來越多的研究顯示,抗原交叉遞呈特異性啟動細胞毒T細胞應答,構成防御病毒、腫瘤和胞外病原微生物的重要一環(huán),而且此抗原遞呈途徑參與維持機體免疫耐受的形成,與Ⅰ型糖尿病、哮喘等自身免疫性疾病的發(fā)病機制有關。因此進一步研究抗原交叉遞呈的機制將有助于自身免疫性疾病治療策略的發(fā)展以及新型疫苗的制備。
　　 樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是機體進行外源抗原交叉遞呈

4、的主要抗原遞呈細胞。外源抗原經DC內化形成吞噬體,經過一系列胞內囊泡融合、轉運,最終將形成的MHC-Ⅰ類肽復合物轉運到細胞膜上才完成整個抗原遞呈過程。近年來為了解此遞呈途徑的胞內機制開展了大量研究,但其相關機制尚不明確。Rodriguez A在Nature報道吞噬可溶性抗原轉運到胞漿,進入MHC-Ⅰ類分子遞呈途徑,卻一直未能鑒定外源抗原從內吞囊泡到胞漿的轉運機制。Houde M和Guermonprez P在Nature提出內質網與吞噬體

5、融合模型來解釋抗原交叉遞呈的途徑,而在2005年Touret N在Nature發(fā)表實驗數據對此模型提出異議。因此,需進一步開展樹突狀細胞抗原遞呈相關的胞內機制研究,有助于我們深入了解此抗原遞呈途徑及其在免疫系統(tǒng)的功能。
　　 在真核細胞中,膜轉運和融合主要由Rab蛋白和SNARE(soluble NSF attachmentprotein receptor,SNARE)蛋白控制。Rab蛋白是一類屬于Ras蛋白家族的小GTP酶,其

6、家族的不同成員高度局限性地定位在各種囊泡的膜表面。通過GDP結合的無活性形式和GTP結合的活性形式之間循環(huán),Rab蛋白在胞漿和膜質結構之間進行轉位,進而在時間和空間上調控囊泡的運輸。另一方面Rab蛋白通過脂酰鏈錨著于胞內各種膜結構,包括質膜的胞漿面,通過與大量的下游效應分子相互作用,并以嚴格受調節(jié)的方式與細胞骨架蛋白相聯系,實現胞內膜結構(及其負載的蛋白)的定向轉運并介導轉運膜結構與靶向囊泡之間的錨著和膜融合過程,在細胞內膜性結構移動中

7、執(zhí)行著中心調動功能。鑒于吞噬體的蛋白質組研究顯示多種Rab蛋白招募到內吞囊泡,參與吞噬體的形成和轉運。因此,我們擬通過研究Rab蛋白對樹突狀細胞抗原交叉遞呈的影響,進而探討樹突狀細胞抗原遞呈中胞內轉運機制和調控機制。
　　 近年大規(guī)模siRNA干擾技術的進展,為系統(tǒng)性研究與樹突狀細胞抗原交叉遞呈相關的Rab蛋白提供了可能。首先,我們采用基于慢病毒的siRNA庫篩選到12個與抗原交叉遞呈相關的Rab分子,包括:Rab3b,3c,4

8、a,5b,6,8b,10,27a,32,33a,34,35。進而,我們合成針對12個Rab分子siRNA進一步驗證了篩選結果,避免siRNA庫篩選中的"off-target"效應。其次,構建EYFP-Rab融合蛋白,采用激光共聚焦觀察陽性Rab分子的分布以及吞噬細菌抗原后招募到吞噬體的情況,發(fā)現一些Rab分子如Rab8b,10,27a,33a,34,35以不同的動力學招募到吞噬體,而其他一些與外吐相關的Rab分子如Rab3b,3c,32

9、與吞噬體不共聚,但位于吞噬體的周圍,并且部分形成管狀結構與細胞膜融合,提示該結構可能參與吞噬體內物質往細胞膜轉運;分析Rab3b,3c,32陽性外吐囊泡的性質,發(fā)現該囊泡為LAMP+Tfn+的非酸性囊泡,提示該囊泡為溶酶體性質的回運囊泡;進一步分析Rab3b,3c囊泡與抗原交叉遞呈中的重要裝配裝置MHC-Ⅰ類分子的共聚情況,發(fā)現MHC-Ⅰ類分子聚集在Rab3b,3c陽性囊泡中;采用β2微球蛋白標識回運的MHC-Ⅰ類分子,發(fā)現儲存在Rab

10、3b,3c陽性囊泡中的MHC-Ⅰ類分子為回運性質的MHC-Ⅰ類分子;而干擾Rab32的DC2.4細胞吞噬細菌抗原后,Rab3b,3c與細胞膜回運MHC-Ⅰ類分子的共聚明顯減少,提示干擾Rab32阻斷了MHC-Ⅰ類向Rab3b,3c囊泡的轉運。由于吞噬體由部分細胞膜形成,細胞膜上的MHC-Ⅰ類分子可能與吞噬顆粒一起形成吞噬體結構,因此該結果提示干擾Rab32阻斷了吞噬體內MHC-Ⅰ類分子(很有可能是MHC-Ⅰ類分子抗原肽復合物)向Rab3

11、b,3c囊泡的轉運,進而向細胞膜上轉運,從而影響抗原交叉遞呈(見示意圖);鑒于此,我們采用慢病毒介導的轉基因制備了樹突狀細胞特異性的Rab32基因沉默轉基因小鼠(簡稱CD11c-GFP-Rab32mir),通過定量PCR檢測CD11c-GFP-Rab32mir轉基因小鼠骨髓來源樹突狀細胞中Rab32表達,發(fā)現Rab32轉基因鼠中樹突狀細胞Rab32表達明顯低于對照組,提示轉基因小鼠的制備成功,進一步采用該細胞進行抗原遞呈分析,結果CD1

12、1c-GFP-Rab32mir轉基因小鼠來源樹突狀細胞對細菌抗原交叉遞呈能力顯著低于對照組,但是MHC-Ⅱ類分子限制性的抗原遞呈沒有影響,提示Rab32特異性的調控樹突狀細胞的交叉遞呈。由于樹突狀細胞功能缺失導致T細胞功能異常,為此我們還分析了CDllc-GFP-Rab32mir轉基因小鼠T細胞功能狀態(tài),結果發(fā)現T細胞的活化、記憶均沒有明顯變化,CD4+T細胞,CD8+T細胞的比例以及調節(jié)性T細胞的比例也正常。說明CD11c-GFP-R

13、ab32mir轉基因小鼠T細胞功能狀態(tài)比較正常,但是在負載抗原后,其T細胞狀態(tài)和亞群是否有改變需要進一步的實驗來證實。
　　 總之,本研究通過RNA干擾篩選獲得一些與樹突狀細胞抗原交叉遞呈相關的Rab分子,進一步分析發(fā)現樹突狀細胞中存在回運性質的Rab3b,3c,32陽性溶酶體相關細胞器參與抗原交叉遞呈,并且干擾Rab32阻斷了吞噬體內回運MHC-Ⅰ類向Rab3b,3c囊泡的轉運,進而影響抗原交叉遞呈。提示回運相關的囊泡在聯系吞