人工抗原遞呈細(xì)胞K32-4-1BBL-CD86的制備及其功能的初步研究.pdf

1、腫瘤的過(guò)繼免疫治療(Adoptive immunotherapy,AIT)一直是腫瘤生物治療研究中最為活躍的一個(gè)領(lǐng)域，輸入自體來(lái)源的抗原特異性T細(xì)胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)不僅可特異、有效殺死靶細(xì)胞，還可克服因體內(nèi)免疫細(xì)胞的“無(wú)能”狀態(tài)導(dǎo)致疫苗治療效果的低下問(wèn)題。 本課題首先構(gòu)建pV4-1BBI,-CD86和pcDNA3.1(+)-CD32a兩個(gè)真核表達(dá)載體，并先后轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選得到穩(wěn)定

2、表達(dá)4-1BBI、CD86和CD32a的細(xì)胞系命名為K32/4-1BBL/CD86。然后將K32/4-1BBL/CD86細(xì)胞和CD3單抗孵育后作用人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Pefipheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)，分別觀察其刺激CD4<'+>T和CD8<'+>T細(xì)胞的活化、CD3<'+>T細(xì)胞的增殖與分裂、PBMC的抗凋亡能力、以及CTL細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ和穿孔素的能力。最后利用移植腫瘤動(dòng)物模型，

3、將用此人工APC(K32/4-1BBL/CD86)體外刺激活化的PBMC注入瘤組織內(nèi)，觀察其抑制腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)。 一、人工抗原遞呈細(xì)胞K32/4-1BBL/CD86的制備 淋巴細(xì)胞的活化需要抗原遞呈細(xì)胞提供雙信號(hào)，由MHCI類分子遞呈抗原肽供TCR/CD3復(fù)合體識(shí)別提供第一信號(hào)，由APC表面的共刺激分子如CD86、4-lBBL、ICOSL等提供第二信號(hào)。本課題首先將4-1BBL和CD86的cDNA插入具有兩個(gè)多克隆位點(diǎn)的

4、真核表達(dá)載體pVITR02-mcs，構(gòu)建pV4-1BBL-CD86雙表達(dá)載體。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HLAI類分子缺陷表達(dá)的細(xì)胞株K562，利用潮霉素穩(wěn)定篩選4-1BBL，和CD86共表達(dá)的細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定并進(jìn)一步分選，將其命名為K562/4-1BBL/CD86。然后自人單核細(xì)胞株U937細(xì)胞克隆IgGFc段的低親合力受體CD32a，插入真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)，轉(zhuǎn)染K562/4-1BBIJCD86細(xì)胞，利用G418和潮霉素穩(wěn)定

5、篩選CD32a、4-1BBL和CD86均表達(dá)的K562細(xì)胞，流式細(xì)胞儀鑒定并進(jìn)一步分選，命名為K32/4-1BBIdCD86。K32/4-1BBL/CD86細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞表面的CD32a分子與CD3單克隆抗體的Fc段結(jié)合，CD3單抗特異性結(jié)合T細(xì)胞表面的CD3受體，向T細(xì)胞傳遞第一信號(hào)，由4-1BBL/CD86分子向T細(xì)胞提供共刺激信號(hào)，進(jìn)而活化CD3+T細(xì)胞。 二、體外分析K32/4-1BBL/CD86細(xì)胞活化人PBMC的能力

6、 分離正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞，同時(shí)取培養(yǎng)對(duì)數(shù)期的K32/4-1BBL/CD86細(xì)胞用絲裂霉素C處理。將兩種細(xì)胞按不同比例混合培養(yǎng)，分別觀察K32/4-1BBL/CD86細(xì)胞對(duì)CD4<'+>T細(xì)胞、和CD8<'+>T細(xì)胞活化、CD3<'+>T細(xì)胞增殖和分裂、PBMC抗凋亡能力、細(xì)胞毒活性以及CTL細(xì)胞分泌IFN-γ和穿孔素的影響能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)人PBMC經(jīng)K32/4-1BBL/CD86細(xì)胞刺激后，CD4<'+>T細(xì)胞和CD8<'+>

7、T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001)；CD3<'+>T細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，與對(duì)照組相比，刺激5天后增殖能力提高2倍，刺激8天與刺激5天相比無(wú)明顯變化；CD3<'+>T細(xì)胞的分裂速度明顯加快；活化PBMC的抗凋亡能力明顯提高，與對(duì)照細(xì)胞相比提高6.57倍；活化T細(xì)胞分泌IFN-γ、穿孔素的能力明顯增強(qiáng)，與對(duì)照細(xì)胞相比，分別提高9.14倍和3.8倍(P<0.05)。 三、體內(nèi)觀察K32/4-1BBL/CD86細(xì)胞活

8、化PBMC對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株LS-174-T(HLA-A<,2>陽(yáng)性)，以3×10<'6>個(gè)細(xì)胞/鼠的細(xì)胞密度接種NOD-SCID小鼠腋窩后側(cè)皮下，4天后肉眼可見(jiàn)米粒大小腫瘤。K32/4-1BBL/CD86細(xì)胞經(jīng)同位素照射(100Gy)，并與CD3單抗孵育后，體外刺激HLA-A<,2>陽(yáng)性正常人的PBMC細(xì)胞。于種植腫瘤細(xì)胞后第5天瘤內(nèi)注射體外活化的PBMC，每周一次，共三次，注射活化PBMC細(xì)胞