深低溫冷凍對氣管抗原遞呈細胞及氣管組織細胞活力的影響.pdf

1、目的:因先天性疾病、炎癥、腫瘤及其他原因引起的氣管廣泛性狹窄而需行長段氣管的切除與重建在臨床上并不少見。但氣管由于其特殊的解剖生理特點,當其切除長度超過6cm時由于張力過大將無法吻合。為保持氣道的暢通,各種方式的氣道重建應運而生。目前有人工氣管替代、自體組織代氣管、生物醫(yī)學與組織工程重建氣管及氣管移植。其中氣管移植被認為是氣管重建的首選方法。由于氣管移植和其他器官一樣具有免疫原性,移植后會發(fā)生免疫排斥反應。對于需要進行氣管移植的患者來說

2、,大多數(shù)是腫瘤患者應用免疫抑制劑不僅影響術后恢復,并可導致癌癥復發(fā)。因而近年來深低溫凍儲后的氣管移植備受矚目。冷凍包括低溫(高于-80℃)、深低溫(-80℃)、超深低溫(-196℃)以及反復凍融等方法。冷凍后的組織可以保持其原有的活性和組織完整性,并能削減其免疫原性,這樣既解決了供體的保存問題,又解決了移植后免疫排斥反應的控制問題。
　　 為了解超深低溫(-196℃)條件下氣管組織細胞的免疫原性及存活力,我們利用免疫組化方法觀察

3、大鼠氣管組織的樹突狀細胞,以明確其免疫原性的變化;采用3H-TdR(3H-胸腺嘧啶核苷)體外培養(yǎng)的方法檢測細胞活力。
　　 方法:48只SD大鼠,體重200-250g,購自河北醫(yī)科大學動物實驗中心。隨機分為6組、將其中一組做對照組。切取2.5-3.5cm氣管,切取其邊緣,用免疫組化(OX-62標記)檢測樹突狀細胞的表達,將氣管段分別移入注滿冷凍保護液的凍儲管(2ml)中,每管中放一段氣管,使冷凍保護劑充分浸潤氣管,旋緊管帽。放置

4、于4℃冰箱中平衡4小時,采用程控降溫儀程序降溫,降溫速率1℃/分,降至-80℃迅速投入液氮中保存。24小時,第10天、20天、30天、60天分別取出8只切取其邊緣4-6個氣管軟骨環(huán),經(jīng)復溫后與新鮮氣管做比較,將剩余氣管采用體外培養(yǎng)的方法分析細胞功能和活力,并檢測樹突狀細胞的表達。
　　 組織病理采用石蠟切片HE染色觀察,免疫組化采用SP法。應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析試驗結果。
　　 結果:
　　 1對比凍儲

5、后的氣管組織和新鮮組織的組織學檢查。超深低溫保存后的氣管復溫后和新鮮氣管相比在外觀無明顯差別,稍顯蒼白。正常氣管結構的HE染色可見氣管黏膜表面排列整齊的假復層柱狀纖毛上皮細胞,黏膜及黏膜下層基質(zhì)細胞、腺細胞和血管內(nèi)皮細胞保存完好。軟骨部分結構致密,可見軟骨細胞單獨或多個生長于軟骨陷窩內(nèi)。冷凍后的各組氣管結構基本保持完整,隨著時間的延長部分出現(xiàn)纖毛脫落,上皮破壞,軟骨變化不大。
　　 2對比凍儲后的氣管組織和新鮮組織的免疫組化結果

6、,新鮮氣管組織在氣管冠狀位切片可觀察到上皮層內(nèi)至基膜層組織有少量棕色深染的樹突狀細胞胞體分布,在上皮細咆層間為深淺不一的棕色染色,在粘膜下層混合腺中也有深染樹突狀細胞,平行氣管長軸的基膜層切片可以觀察到大量樹突狀細胞交織成網(wǎng)狀,軟骨層沒有陽性染色。凍存后氣管則組織水腫,樹突狀細胞腫脹,樹突狀突起著色淡染,突起遠端著色不清,細胞分布稀疏。OX-62是大鼠樹突狀細胞比較特異的標志物,在正常新鮮組,其陽性表達共8例,其中強陽性6例,陽性1例,

7、弱陽性1例;在冷凍后24小時,其陽性表達共8例,其中強陽性4例,陽性2例,弱陽性2例,陰性O例:在冷凍后10天,其陽性表達共8例,其中強陽性5例,陽性2例,弱陽性1例,陰性0例;在冷凍后20天,其陽性表達共7例,其中強陽性1例,陽性3例,弱陽性4例,陰性0例;在冷凍后30天,其陽性表達共5例,其中強陽性0例,陽性1例,弱陽性4例,陰性3例;在冷凍后60天,其陽性表達共1例,其中強陽性0例,陽性O例,弱陽性1例,陰性7例;結果顯示,OX-

8、62在冷凍24小時、冷凍10天與正常組相比差異不顯著(P＞0.05),OX-62在冷凍20天、30天、60天組表達顯著低于正常組(P＜0.05,且隨著冷凍時間的延長,其表達逐漸遞減。
　　 33H-TdR摻入率在冷凍前測定值為35.18±3.30CPM/mg,冷凍后24小時為28.39±3.20 CPM/mg,約占冷凍前的80％;冷凍后10天為26.28±2.62CPM/mg,約占冷凍前的74％;冷凍后20天為25.05±2.8

9、5CPM/mg,約占冷凍前的71％;冷凍后30天為24.85+3.01CPM/mg,約占冷凍前的70.6％;冷凍后60天為24.59±2.44CPM/mg,約占冷凍前的65.2％。
　　 結論:
　　 1凍儲氣管的OX-62表達下降(≥20天),統(tǒng)計學意義相差顯著,提示凍儲氣管的免疫原性降低可能是由于樹突狀細胞明顯減少,其功能和活性降低,樹突狀細胞在凍儲過程中受到了損傷。
　　 23H-TdR在細胞增殖過程中合成

10、到染色體中,細胞死亡后不會吸收,因此可作為細胞活力的標志。通過對3H-TdR摻入率檢測結果分析,氣管低溫保存后24小時其摻入率就明顯降低,此后降低逐漸變緩。
　　 3綜合我們的研究結果表明,通過檢測冷凍后不同時段的樹突狀細胞表達及樹突狀細胞的變化以及冷凍后氣管組織細胞的活力,發(fā)現(xiàn)冷凍60天的氣管免疫原性最低,但氣管組織細胞活力只有冷凍前的65％,冷凍24小時的氣管組織細胞活力是冷凍前的80％,但免疫原性很高;綜合比較后冷凍30天