幼年期癲癇持續(xù)狀態(tài)對(duì)海馬細(xì)胞因子表達(dá)的影響及干預(yù)措施的研究.pdf

1、研究背景：
　　 癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)是指一次癲癇發(fā)作持續(xù)30分鐘以上,或連續(xù)多次發(fā)作、發(fā)作間期意識(shí)和神經(jīng)功能未恢復(fù)至通常水平,是神經(jīng)科常見急癥之一,若處理稍有不當(dāng),就會(huì)給患者帶來終身殘疾,甚至危及生命。從年齡分布看,SE在嬰幼兒期發(fā)病率高:37％的SE發(fā)生于1歲以內(nèi),73％發(fā)生于3歲以內(nèi),83％發(fā)生于5歲以內(nèi)。幼年時(shí)期發(fā)生的SE是否會(huì)損傷患兒的腦功能、影響患兒以后的智力行為發(fā)育是兒科醫(yī)生和患兒家屬關(guān)注的問題。
　　 幼

2、年兒童經(jīng)歷一次癲癇持續(xù)狀態(tài)后應(yīng)該應(yīng)用抗癲癇藥物進(jìn)行治療。本研究將從腦保護(hù)角度探索,幼年期大鼠經(jīng)歷一次SE后給予不同抗癲癇藥物,對(duì)大鼠海馬部位的膠質(zhì)細(xì)胞激活情況及細(xì)胞因子表達(dá)情況是否有所影響,以及應(yīng)用抗癲癇藥物后海馬對(duì)第二次驚厥打擊的易損性是否有所改變。
　　 納洛酮是一種在兒科應(yīng)用較廣泛的藥物,用于新生兒窒息的復(fù)蘇及促醒。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)納洛酮具有抑制炎癥反應(yīng)和保護(hù)神經(jīng)元的作用。介于P15大鼠在SE后短期內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活、而星形

3、膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)期激活,且膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生細(xì)胞因子,我們猜想應(yīng)用納洛酮也可抑制幼年期SE后海馬內(nèi)的炎癥反應(yīng),并對(duì)海馬的易損性產(chǎn)生一定的影響。
　　 目的：
　　 1研究幼年期(P15)大鼠經(jīng)歷SE后,在急性期和慢性期,海馬區(qū)各種細(xì)胞因子在翻譯和蛋白表達(dá)水平上的變化。
　　 2應(yīng)用相應(yīng)的細(xì)胞因子抗體研究細(xì)胞因子與海馬易損性增強(qiáng)之間的關(guān)系。
　　 3在P15大鼠經(jīng)歷SE后,連續(xù)給予苯巴比妥、丙戊酸鈉、托吡酯、拉莫三嗪

4、、左乙拉西坦進(jìn)行單藥治療,觀察慢性期星形膠質(zhì)細(xì)胞激活情況和細(xì)胞因子的變化及應(yīng)用這些藥物后大鼠對(duì)二次驚厥打擊易損性的變化。
　　 4在P15大鼠經(jīng)歷SE后,給予納洛酮治療,觀察急、慢性期膠質(zhì)細(xì)胞激活情況和細(xì)胞因子的變化及大鼠對(duì)二次驚厥打擊易損性的變化。
　　 方法
　　 1幼年期(P15)大鼠經(jīng)歷SE后海馬細(xì)胞因子表達(dá)的改變:將P15大鼠隨機(jī)分為2組,SE組(60只),對(duì)照組(60只)；SE組和對(duì)照組又各自分為6小

5、組(每小組10只),在不同的時(shí)間點(diǎn)處死,取出海馬組織進(jìn)行細(xì)胞因子的檢測(cè)。SE組給予海人藻酸(KA)5mg/kg腹腔注射致SE,對(duì)照組給予同樣體積的生理鹽水腹腔注射。在模型建立后12小時(shí)、24小時(shí)、3天、10天、20天、30天6個(gè)時(shí)間點(diǎn),分別取SE組和對(duì)照組中的10只大鼠,提取海馬中的蛋白和mRNA,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Elisa)和熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)白介素1β(IL-1β)、白介素2(IL-2)、白介素4(I

6、L-4)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、白介素12(IL-12)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、干擾素γ(IFNγ)的表達(dá)。
　　 2表達(dá)增高的細(xì)胞因子與大鼠海馬易損性增強(qiáng)之間的關(guān)系:將P15大鼠分為SE組(10只)、干預(yù)組(40只)、對(duì)照組(10只)。其中干預(yù)組分為4小組(每小組10只)。SE組給予KA5mg/kg腹腔注射致SE；干預(yù)組分別在KA致SE后12小時(shí)給予IL-1β抗體側(cè)腦室內(nèi)注射,20天時(shí)給予IL-

7、1β抗體、IL-10抗體、TNFα抗體側(cè)腦室內(nèi)注射；對(duì)照組在P15時(shí)給予同等體積生理鹽水腹腔注射。各組大鼠在P45時(shí)給予KA15mg/kg腹腔注射致SE,P50時(shí)行Morris水迷宮測(cè)試,P55時(shí)原位末端標(biāo)記(TUNEL)法標(biāo)記海馬凋亡細(xì)胞。
　　 3抗癲癇藥物對(duì)幼年期SE后慢性期星形膠質(zhì)細(xì)胞激活、細(xì)胞因子表達(dá)及易損性的影響:將P15大鼠分為6組,SE組、苯巴比妥治療組、丙戊酸鈉治療組、托吡酯治療組、拉莫三嗪治療組、左乙拉西坦治

8、療組(每組20只)。SE組大鼠給予KA腹腔注射致SE。五個(gè)藥物治療組分別在P15經(jīng)歷SE后,連續(xù)給藥7天(苯巴比妥30mg/kg/天、丙戊酸鈉200mg/kg/天、托吡酯40mg/kg/天、拉莫三嗪50mg/kg/天、左乙拉西坦200mg/kg/天)。在P45每組取10只大鼠對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(GFAP)和細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè),每組剩余10只給予KA15mg/kg腹腔注射后致第二次SE,P55時(shí)檢測(cè)海馬凋亡細(xì)胞。
　　 4納洛酮對(duì)

9、幼年期經(jīng)歷SE大鼠的保護(hù)作用:P15大鼠分為SE組、納洛酮治療組、對(duì)照組。SE組大鼠P15時(shí)給予KA5mg/kg致SE,納洛酮治療組大鼠在P15時(shí)致SE后皮下植入微泵12小時(shí)內(nèi)泵入不同劑量納洛酮,生理鹽水對(duì)照組大鼠腹腔注射與KA同等體積生理鹽水。應(yīng)用免疫印跡檢測(cè)大鼠海馬區(qū)急慢性期膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(Iba-1、GFAP、S100β)表達(dá)情況,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)情況。各組大鼠在P45時(shí)均再次給予KA1

10、5mg/kg腹腔注射致SE,P50時(shí)行Morris水迷宮測(cè)試,P55時(shí)觀察比較海馬區(qū)凋亡細(xì)胞。
　　 結(jié)果：
　　 1幼年期(P15)大鼠SE后細(xì)胞因子表達(dá)的改變:幼年期SE可導(dǎo)致海馬區(qū)細(xì)胞因子在不同時(shí)段的改變。IL-1β在幼年期SE后早期(P<0.001)及慢性期(P<0.001)均表達(dá)顯著增高,而IL-10(P<0.01)和TNFα(P<0.01)在幼年期SE后慢性期較對(duì)照組大鼠表達(dá)顯著增高。其余細(xì)胞因子在各檢測(cè)時(shí)間

11、點(diǎn)無明顯表達(dá)改變(P>0.05)。
　　 2表達(dá)增高的細(xì)胞因子與大鼠海馬易損性增強(qiáng)之間的關(guān)系:SE組大鼠(在P15和P45均經(jīng)歷SE)水迷宮測(cè)試表現(xiàn)差于對(duì)照組大鼠(只在P45經(jīng)歷SE)(P<0.001)、SE組大鼠海馬區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組大鼠(P<0.01)；大鼠在P15經(jīng)歷SE后12小時(shí)和20天側(cè)腦室內(nèi)注射IL-1β抗體均可改善大鼠在水迷宮測(cè)試中的表現(xiàn)(P<0.01)、顯著減少其在P45第二次SE后海馬區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)(P<

12、0.05)；在P15大鼠經(jīng)歷SE后20天海馬內(nèi)注射IL-10抗體可加劇大鼠在水迷宮測(cè)試中空間記憶能力減退(P<0.05)、明顯增加其在P45第二次SE后海馬凋亡細(xì)胞(P<0.05)；而SE后20天側(cè)腦室內(nèi)注射TNFα抗體可改善大鼠在水迷宮測(cè)試中的表現(xiàn)(P<0.05)、顯著減少大鼠在P45第二次SE后海馬凋亡細(xì)胞(P<0.01)。
　　 3抗癲癇藥物對(duì)幼年期SE后慢性期星形膠質(zhì)細(xì)胞激活、細(xì)胞因子表達(dá)及易損性的影響:苯巴比妥和拉莫三

13、嗪治療對(duì)P15大鼠經(jīng)歷SE后慢性期GFAP表達(dá)、細(xì)胞因子表達(dá)及易損性均無顯著影響(P>0.05)。丙戊酸鈉治療對(duì)慢性期GFAP表達(dá)無明顯影響(P>0.05),但可減少慢性期海馬內(nèi)IL-1β、IL-10、TNFα的表達(dá)(P<0.05),并減少其在P45時(shí)SE后凋亡細(xì)胞數(shù)(P<0.01)。托吡酯治療組大鼠與SE組大鼠相比,GFAP和細(xì)胞因子表達(dá)無明顯差異(P>0.05),但托吡酯治療組大鼠在P45經(jīng)歷SE后海馬區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)顯著少于SE組大鼠

14、(P<0.05)。左乙拉西坦治療組大鼠慢性期海馬內(nèi)GFAP含量較SE組明顯減少(P<0.01),且IL-1β、TNFα表達(dá)顯著減少(P<0.01),在經(jīng)歷P45時(shí)SE后海馬內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)少于SE組大鼠(P<0.01)。
　　 4納洛酮對(duì)幼年期經(jīng)歷SE大鼠的保護(hù)作用:P15大鼠經(jīng)歷SE后12小時(shí)內(nèi)皮下微泵注射納洛酮可顯著降低急性期海馬內(nèi)Iba-1、GFAP、S100β表達(dá)水平(P<0.01),降低慢性期GFAP、S100β表達(dá)水平(

15、P<0.001)。納洛酮治療可使急性期海馬內(nèi)IL-1β和慢性期海馬內(nèi)IL-1β、TNFα、IL-10表達(dá)減少(P<0.01)。納洛酮治療可改善大鼠在P45第二次SE后在Morris水迷宮測(cè)試中的表現(xiàn)(P<0.01),使海馬區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1大鼠在幼年期(P15)經(jīng)歷SE可導(dǎo)致海馬區(qū)急性期IL-1β表達(dá)增高,慢性期海馬區(qū)IL-1β、IL-10、TNFα表達(dá)增高。
　　 2

16、大鼠在P15經(jīng)歷SE后急性期及慢性期海馬區(qū)增高的IL-1β增加了海馬對(duì)P45時(shí)第二次SE的易損性；慢性期增高的IL-10對(duì)海馬起保護(hù)作用,可以減輕海馬對(duì)第二次SE打擊的易損性；慢性期增高的TNFα可增加海馬對(duì)成年期二次驚厥的易損性。
　　 3幼年期(P15)大鼠經(jīng)歷SE后給予苯巴比妥、拉莫三嗪治療對(duì)于其海馬易損性增強(qiáng)無改善作用；丙戊酸鈉可通過抑制慢性期海馬內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)減輕其易損性；托吡酯雖然對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活和細(xì)胞因子表達(dá)無影