豬源鐵調(diào)素Hepcidin抑菌特性及其在細菌感染細胞中的作用研究.pdf

1、鐵調(diào)素(Hepcidin)是一種兼具抗菌和調(diào)節(jié)機體鐵代謝功能的抗菌肽。目前對Hepcidin調(diào)鐵功能的研究已經(jīng)很透徹，但是對豬源Hepcidin(Porcine Hepcidin，pHepc)的研究甚少。本試驗對pHepc體外抗菌活性、抗菌機制及安全性進行了評估，并通過胞內(nèi)菌和胞外菌感染豬腸道上皮細胞系IPEC-1、人結(jié)腸腺癌細胞系Caco-2和豬肺泡巨噬細胞3D4/2，探究了pHepc在細菌感染宿主細胞中發(fā)揮的作用。圍繞此開展了以下試

2、驗:
　　試驗一 pHepc體外抗菌活性及其機制的研究
　　試驗采用瓊脂糖擴散、菌落計數(shù)、透射電鏡和DNA凝膠電泳阻滯方法研究了pHepc對幾株常見致病菌的抗菌活性。研究發(fā)現(xiàn):①人工合成的pHepc對受試菌具有抑菌活性，能夠抑制所有受試菌的生長，并且存在劑量依賴效應(yīng)。其中，金黃葡萄球菌ATCC25923對pHepc最敏感，最高濃度的pHepc可以減少2 log CFU/ml金黃葡萄球菌ATCC25923細菌數(shù)量。相比之下，p

3、Hepc只減少1.5 log CFU/ml其他受試菌數(shù)量。②pHepc是豬內(nèi)源表達產(chǎn)生的，因此我們探究了不同生理基質(zhì)對pHepc抑菌活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pHepc具有廣泛的pH適應(yīng)條件，在pH6.0-8.0范圍內(nèi)可以抑制大腸桿菌K88，而對于金黃葡萄球菌能在略廣的pH范圍內(nèi)(pH4.0-8.0)發(fā)揮抑菌活性。但是用仔豬血清處理pHepc30 min后，肽的抑菌活性喪失。③由于pHepc在調(diào)節(jié)機體鐵代謝中發(fā)揮著重要功能，因此我們研究了鐵

4、對pHepc抑菌活性的影響。結(jié)果顯示:pHepc在較高的鐵離子濃度下仍然能發(fā)揮較強的抗菌活性，說明其抑菌活性并不依賴鐵離子。
　　進一步對pHepc抑菌機制的研究發(fā)現(xiàn)pHepc可以提高大腸桿菌K88和金黃色葡萄球菌ATCC25923細菌表面疏水性。利用SYTOX攝取試驗和透射電鏡觀察等方法揭示了pHepc同時存在膜作用機制和胞內(nèi)作用機制，且對細胞膜的破壞作用存在劑量依賴性，64μg/ml的pHepc使得受試菌膜均受到一定程度的破損

5、。pHepc作用細菌后，菌體電子密度分布不均一，兩級和中間出現(xiàn)空泡化，細菌內(nèi)容物泄露，還引起部分大腸桿菌K88菌體變長。同時還發(fā)現(xiàn)pHepc能夠有效結(jié)合細菌質(zhì)粒DNA，抑制其遷移。
　　試驗二 pHepc在細菌感染宿主細胞中發(fā)揮的作用研究
　　根據(jù)試驗一的結(jié)果，我們選取胞外菌大腸桿菌K88和金黃色葡萄球菌ATCC25923，以及胞內(nèi)菌鼠傷寒沙門氏菌CMCC50013開展了細菌感染細胞試驗。結(jié)果顯示:pHepc在胞內(nèi)菌和胞外菌

6、感染機體中發(fā)揮不同的作用。在胞外菌感染細胞試驗中，相比于細菌感染組，陰性肽pHepcC-A（將pHepc的8個半胱氨酸全部替換為丙氨酸的直鏈肽）沒有減少受試菌粘附和入侵細胞的數(shù)量。而pHepc處理可以顯著減少大腸桿菌K88和金黃色葡萄球菌ATCC25923的細菌數(shù)量。通過光學顯微鏡鏡檢、吉姆薩染色和掃描電鏡觀察，結(jié)果表明:pHepc使得大腸桿菌K88發(fā)生聚集。相反的，對于胞內(nèi)菌鼠傷寒沙門氏菌CMCC50013，pHepc處理可顯著增加粘

7、附和入侵Caco-2細胞和3D4/2巨噬細胞的細菌數(shù)量。通過在不同感染時間點統(tǒng)計入侵菌的數(shù)量結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)pHepc處理后，細胞內(nèi)的細菌繁殖明顯增加，提示可能與胞內(nèi)鐵離子濃度相關(guān)。進一步的蛋白電泳結(jié)果顯示，pHepc處理使細胞膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白Fpn發(fā)生了部分降解，使鐵的輸出受到抑制從而使胞內(nèi)鐵濃度升高。同時，用鐵螯合劑螯合細胞內(nèi)鐵離子后，胞內(nèi)細菌數(shù)量顯著減少，表明胞內(nèi)菌的生長是鐵依賴性的，pHepc處理后使胞內(nèi)細菌快速生長確實與胞內(nèi)鐵離子濃度存

8、在一定關(guān)系。鼠傷寒沙門氏菌CMCC50013感染巨噬細胞3D4/2的實驗還顯示，pHepc處理顯著緩解感染引起的炎性細胞因子IL-1α、IL-6、IL-8、TNF-αmRNA表達量的上調(diào)(p＜0.05)。單獨添加pHepc和pHepcC-A均對細胞M1型極化標志因子TNF-α、IL-6、IL-1β等分泌沒有顯著影響(p＞0.05)。
　　綜上，本研究結(jié)果表明，pHepc在豬體內(nèi)發(fā)揮著重要的抗菌功能，該研究可能對保障機體健康提供思路