體內(nèi)電穿孔遞送途徑在DNA疫苗中的應(yīng)用以及DNA疫苗載體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的dsRNA的佐劑效應(yīng)研究.pdf

1、DNA疫苗是一種很有希望的新型疫苗策略。如何大幅度提高DNA疫苗的免疫原性是其發(fā)展所面臨的首要問題，如何把質(zhì)粒DNA高效率導(dǎo)入宿主細(xì)胞以及如何實(shí)現(xiàn)抗原蛋白的高效率呈遞是DNA疫苗的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 首先，本論文應(yīng)用體內(nèi)電穿孔技術(shù)增強(qiáng)DNA疫苗的遞送效率。我們構(gòu)建了熒光素酶(Luciferase)表達(dá)質(zhì)粒p1.0-luc，將其通過直接肌肉注射、肌注后以雙針電極進(jìn)行電穿孔、肌注后以鉗式電極進(jìn)行電穿孔等三種不同方法注射小鼠，72小時(shí)后取

2、注射部位的肌肉測定Luciferase的表達(dá)情況。同時(shí)構(gòu)建攜帶密碼子優(yōu)化的HIV-1B'/C重組亞型CN54株gag基因的DNA疫苗質(zhì)粒p1.0-gag，在10μg、100μg兩個(gè)劑量水平上通過以上三種不同的方法免疫Balb/c雌性小鼠，EUSA方法檢測Gag特異的抗體反應(yīng)，ELISPOT方法和細(xì)胞內(nèi)因子染色技術(shù)檢測細(xì)胞免疫應(yīng)答。結(jié)果表明應(yīng)用體內(nèi)電穿孔技術(shù)可以使Luciferase在小鼠肌肉中的表達(dá)水平顯著提高(最高達(dá)到66倍)，并增強(qiáng)

3、了Gag特異的體液免疫應(yīng)答(最高達(dá)到28倍)，顯示了體內(nèi)電穿孔技術(shù)在DNA疫苗遞送方面的良好作用，其中使用雙針電極的效果要顯著好于鉗式電極。同時(shí)，研究表明體內(nèi)電穿孔對于Gag特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答并沒有顯著影響。 其次，本論文創(chuàng)造性地構(gòu)建了能夠在抗原表達(dá)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈RNA(dsRNA)分子的新型DNA疫苗載體，探索dsRNA分子對DNA疫苗的佐劑效果。我們構(gòu)建了一雙表達(dá)盒的DNA質(zhì)粒pDRVI3.1，并克隆入3個(gè)含回文結(jié)構(gòu)的D

4、NA片段(包括正義鏈-莖環(huán)序列-反義鏈)，獲得質(zhì)粒pDS40、pDS200及pDS750，通過在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，可分別形成長度為40bp、200bp和750bp的dsRNA分子(含9nt或12nt的環(huán))。我們利用上述載體分別構(gòu)建了攜帶luciferase基因、HIV-1env基因、HIV-1 nef基因的重組質(zhì)粒。體內(nèi)外基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明，長的750bp dsRNA分子能夠顯著抑制外源基因表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。小鼠免疫結(jié)果表明

5、，在相同的免疫劑量和免疫次數(shù)下，攜帶短的40bp dsRNA：表達(dá)盒的DNA疫苗所誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)顯著高于傳統(tǒng)DNA疫苗所誘導(dǎo)的反應(yīng)水平(最高達(dá)到4倍)；在低1個(gè)數(shù)量級(jí)的質(zhì)粒劑量或少1次免疫注射的情況下，攜帶短的40bp dsRNA表達(dá)盒的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)出與傳統(tǒng)DNA疫苗相同水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答；而攜帶750bp dsRNA表達(dá)盒的質(zhì)粒不能增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。同時(shí)，dsRNA表達(dá)盒在誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答方面不具備優(yōu)勢，甚至降低了體液