MBL基因多態(tài)性及其血漿濃度與新生兒感染的關(guān)系.pdf

1、感染是導(dǎo)致新生兒，尤其是早產(chǎn)兒和低出生體重兒發(fā)病和死亡的一個重要的、常見的原因，其嚴重影響兒童的生長發(fā)育和智力發(fā)育，給社會和家庭帶來巨大的經(jīng)濟負擔。已有的文獻報道，新生兒感染易發(fā)生于先天性免疫功能低下的患兒，與遺傳、先天性免疫系統(tǒng)發(fā)育異常等因素有關(guān)。近年來的研究表明，甘露糖結(jié)合凝集素（mannose-binding lectin，MBL）缺陷作為最常見的免疫缺陷狀態(tài)，是我國新生兒感染的重要原因。MBL是先天性免疫系統(tǒng)的重要分子，它可以與

2、病原微生物表面的糖鏈結(jié)合，通過膠原樣區(qū)激活MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶，進而激活補體系統(tǒng)，對適應(yīng)性免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟的新生兒尤其是早產(chǎn)兒，甘露糖結(jié)合凝集素在防御抵抗多種病原微生物感染的天然免疫中起著重要的作用，是嬰幼兒非特異性免疫系統(tǒng)中的一線抗感染分子。血漿MBL濃度主要受其基因多態(tài)性影響：基因編碼區(qū)的突變可以破壞MBL膠原樣區(qū)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致MBL多肽鏈不能寡聚化，而易被降解成無功能蛋白。啟動子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleoti

3、de polymorphisms，SNPs）則從轉(zhuǎn)錄水平影響MBL的濃度。目前研究主要集中在MBL基因啟動子區(qū)的-550，-221和5'UTR+4位點和外顯子1區(qū)+223、+230和+239位點的基因多態(tài)性上。
　　本研究通過PCR（Polyrnerase Chain Reaction，PCR）和直接測序的方法，分析福建地區(qū)新生兒MBL基因已知六個位點的多態(tài)性，并試圖發(fā)現(xiàn)新的基因多態(tài)性位點，進一步探討MBL基因多態(tài)性-血漿MBL濃

4、度-新生兒感染三者之間的關(guān)系。
　　目的：1.研究福建地區(qū)漢族新生兒MBL啟動子區(qū)和外顯子1已知6個位點的基因型及由此所構(gòu)成的單體型。
　　2.分析MBL基因型及其單體型在早產(chǎn)兒和足月兒間的差異，探討MBL基因多態(tài)性與早產(chǎn)的相關(guān)性。
　　3.探討MBL基因型及其單體型與血漿MBL濃度的相關(guān)性。
　　4.分析MBL基因多態(tài)性、血漿MBL濃度與新生兒感染包括肺炎、敗血癥之間的相關(guān)性。
　　5.發(fā)現(xiàn)本地區(qū)漢族新生

5、兒MBL基因新的多態(tài)性位點。
　　方法：1.收集福建省婦幼保健院新生兒救護中心2013年1-6月期間的182例患兒，其中對照組87例，感染組95例，分為新生兒肺炎組和新生兒敗血癥組，其診斷主要依據(jù)患兒的臨床癥狀、實驗室數(shù)據(jù)和影像學(xué)資料。
　　2.針對擬研究的6個位點的序列，自行設(shè)計引物。提取全血 DNA后進行 PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測序分析。
　　3.用ELISA法檢測不同基因型的血漿MBL濃度。
　　4.

6、收集患兒的病例資料以及相關(guān)的實驗室數(shù)據(jù)，并用SPSS軟件分析MBL基因型及單體型與新生兒感染的關(guān)系。
　　結(jié)果：1.182例漢族新生兒中啟動子區(qū)-550位點G/G、G/C和C/C基因型頻率分別為0.236、0.489和0.275，G和C型等位基因頻率分別為0.481和0.519。-221位點C/C、C/G和G/G基因型頻率為0.055、0.308和0.637，C和G等位基因頻率分別為0.209和0.791。5’UTR+4位點C/C

7、、C/T和T/T基因型頻率為0.764、0.214和0.022，C和T等位基因頻率為0.87和0.13。經(jīng)χ2檢驗，啟動子區(qū)3個位點的等位基因頻率符合Hardy-weinberg平衡。+230位點G/G、G/A和A/A基因型頻率為0.731、0.247和0.022，G和A等位基因頻率分別為0.854和0.146。經(jīng)χ2檢驗，該位點的等位基因頻率也符合Hardy-weinberg平衡。
　　2.經(jīng)SHEsis軟件分析，-550、-2

8、21位點和+230位點間均存在較高度的連鎖不平衡。本研究中包括啟動子和外顯子1區(qū)的單體型共有6種：HYPA、LYPB、LYPA、LXPB、LXPA和LYQA，其中HYPA最常見，頻率為0.463，其他單體型頻率分別為0.137、0.062、0.009、0.2和0.111。
　　3.早產(chǎn)組和足月兒組啟動子區(qū)域的三個關(guān)鍵位點中，-550位點變異型等位基因頻率在足月兒組和早產(chǎn)兒組無顯著性差異（χ2值為2.04，P>0.05）。-221位

9、點在早產(chǎn)兒組C和G等位基因頻率分別為0.268和0.732，而足月兒組C和G等位基因頻率分別為0.160和0.840，兩者間具有顯著性差異(χ2值為5.9,P<0.05)。+4位點的 C和 T型等位基因頻率在早產(chǎn)兒組和足月兒組間無顯著性差異(χ2值0.467,P>0.05)。外顯子1區(qū)三個關(guān)鍵位點中只有+230位點多態(tài)性改變，其中G和A等位基因頻率在早產(chǎn)兒和足月兒組中無顯著性差異(χ2值為0.739，P>0.05)。共檢出5種單體型LX

10、PA、LYPB、LYPA、LYQA和HYPA，其中早產(chǎn)兒組LXPA明顯高于足月兒組，OR值1.794(95％CI1.06～3.017，P<0.05)，而LYPB在足月兒組明顯高于早產(chǎn)兒組，其OR值0.533(95%CI0.28～0.99，P<0.05)，其它三種單體型在兩組之間差別無顯著性差異。
　　4.除了6個已知位點的多態(tài)性改變外，還發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)-327到-332位點間AGAGAA共6個堿基丟失，且有4例出現(xiàn)純合性丟失。同時在

11、該位點的上下游同時出現(xiàn)了-435G/A、-427A/C、-349A/G、-336A/G和-70C/T的多態(tài)性改變。經(jīng)連鎖不平衡檢驗發(fā)現(xiàn) c.4665-4670delAGAGAA、-435G/A、-427A/C、-349A/G、-336A/G和-70C/T各多態(tài)位點間具有強連鎖性。
　　5．MBL基因啟動子區(qū)-550和+4位點變異型等位基因頻率在感染組和對照組之間無顯著性差別，感染組-221位點變異型等位基因頻率高于正常對照組(0.

12、722 vs0.644，χ2=7.14，P<0.05)，+230位點感染組的A型等位基因頻率為0.141，而對照組中則為0.061，感染組顯著高于對照組(χ2=6.4，P<0.05)。比較不同組別MBL單體型頻率發(fā)現(xiàn)，感染組LYPB和LYQA的頻率高于對照組(0.129 vs0.021、0.152 vs0.001,χ2=14.74、27.9,P<0.005)，而LYPA的頻率低于對照組(0.072 vs0.238,χ2=20.2,P<0

13、.05)，其它單體基因型頻率在疾病組與對照組間相比無顯著性差異。
　　6.對照組的MBL濃度中位數(shù)1560 ng/ml，感染組MBL濃度中位數(shù)452 ng/ml，對照組血漿MBL濃度明顯高于感染組，差別有顯著性意義(z=-4.566，P=0.000)。同時將感染組分成新生兒肺炎組和敗血癥組，將對照組和各疾病組MBL濃度進行比較，其中位數(shù)值分別為1560ng/ml、445 ng/ml和770 ng/ml，差別有顯著性意義(Z值分別為

14、-4.33和-2.85，P<0.05)。而各疾病組間濃度差異無顯著性。
　　7.基因型與MBL濃度的關(guān)系：外顯子是影響血漿MBL表達的最關(guān)鍵因素，產(chǎn)物表達A/A>A/B>B/B，其血漿MBL濃度中位數(shù)分別為2409ng/ml、1069 ng/ml和33.3ng/ml，有顯著性差異（P<0.001）。在外顯子相同的情況下，HYP/HYP型患者的MBL濃度（3400 ng/ml）最高，而LYP/LYQ型濃度（310 ng/ml）最低。

15、
　　結(jié)論：1.我省漢族MBL基因-550、-221、+4和+230位點呈現(xiàn)不同程度的多態(tài)性改變；+223和+239位點均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性改變。
　　2.我省漢族新生兒單體型有HYPA、LYPB、LYPA、LXPB、LXPA和LYQA，其中以HYPA最多見；新發(fā)現(xiàn)LYQ A單體基因型。
　　3.單體型在早產(chǎn)兒和足月兒組中分布頻率不同，LXPA是早產(chǎn)的危險因子，而LYP B是保護因子。
　　4.檢出C.4665-467

16、0delAGAGAA多態(tài)性改變，這些病例中同時出現(xiàn)-435G/A、-427A/C、-349A/G、-336A/G和-70C/T等位點的多態(tài)性改變，各位點間具有強連鎖性。
　　5. MBL基因多態(tài)性改變與新生兒感染相關(guān)，單體型LYPB和LYQA感染組明顯高于正常組，而LYPA則相反。
　　6.低血漿 MBL濃度是引起新生兒感染的危險因素之一；對照組和感染組間MBL濃度顯著性差異，而感染組間MBL水平無顯著性差異。
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