兒童MBL基因多態(tài)與相關(guān)感染的關(guān)系.pdf

1、研究背景與目的甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-bindinglectin，MBL)，又稱甘露聚糖結(jié)合凝集素，是一種鈣離子依賴的(C型)血清凝集素，在防御抵抗多種病原微生物的天然免疫中起著重要的作用，對后天免疫功能尚未成熟的兒童尤其重要。MBL是一個(gè)由若干個(gè)相同的亞單位組成的多聚體分子，每條肽鏈的C端是碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域(carbohydraterecognitiondomain，CRD)，近N端是一膠原樣區(qū)，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)與MBL的生

2、物學(xué)功能密切相關(guān)。其中CRD可以與某些特定的單糖配體結(jié)合，尤其是與病原微生物表面的糖鏈結(jié)合后，可通過膠原樣區(qū)激活MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶，進(jìn)而激活補(bǔ)體系統(tǒng)，這條途徑稱為凝集素途徑。MBL由mbl2編碼，其中啟動(dòng)子區(qū)(-550、-221和+4位點(diǎn))和外顯子1區(qū)(+223、+230和+239位點(diǎn))共6個(gè)單核苷酸的多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，SNP)以及由多個(gè)位點(diǎn)SNP組合而成的單體基因型對產(chǎn)物的表達(dá)影響

3、最大，已逐漸成為國內(nèi)外研究的重點(diǎn)。不同的民族或人種中MBL基因各關(guān)鍵位點(diǎn)的SNP和常見基因型不同，不同的基因型血循環(huán)中MBL水平差異重大，從而造成不同人群對疾病的易感性不同。針對國內(nèi)人種的研究中目前尚無同時(shí)函蓋6個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的文獻(xiàn)記載。感染尤其是呼吸道感染是兒科最常見的疾病，而反復(fù)呼吸道感染是造成患兒住院的最常見疾病之一，對兒童的身心健康造成較大影響，因此關(guān)于反復(fù)呼吸道感染和MBL遺傳缺陷之間的關(guān)系有待進(jìn)一步闡明。本研究的目的是研究本地區(qū)

4、漢族兒童mbl2的SNP、單體基因型以及基因多態(tài)性、血漿MBL蛋白表達(dá)水平與反復(fù)感染的相關(guān)關(guān)系，并試圖發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)。 第一部分我省漢族兒童MBL基因啟動(dòng)子區(qū)-550和-221位點(diǎn)、5'UTR+4位點(diǎn)、外顯子1區(qū)+223、+230和+239位點(diǎn)SNP與單體基因型研究目的闡明我省漢族兒童包括健康組和感染組在內(nèi)群體的MBL基因SNP和單體基因型，并與國內(nèi)外同類研究比較。 研究方法(1)研究對象：共206例漢族兒童，包括健康

5、組105例和疾病組101例，疾病組由57例反復(fù)呼吸道感染(repeatedrespiratorytractinfection，RRTI)，21例急性呼吸道感染(acuterespiratorytractinfection,ARTI)，13例局部膿腫和10例中耳炎組成。(2)全血標(biāo)本采集和基因組DNA抽提：抽取靜脈血1.5ml，以EDTA抗凝，分離血漿后，以0.87％的氯化胺分離白細(xì)胞，以Qiagene公司的DNA提取試劑盒bloodmi

6、nikit從白細(xì)胞中提取基因組DNA。(3)MBL基因SNP和單體基因型分析：用序列特異性引物PCR法和PCR產(chǎn)物序列分析法完成所有標(biāo)本6個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的SNP分析，單體基因型分析并結(jié)合分子克隆的結(jié)果。 結(jié)果(1)PCR-SSP法分析MBL基因SNP的敏感性和特異性：以序列分析法為標(biāo)準(zhǔn)，PCR-SSP法檢測-550位點(diǎn)H/H、H/L和L/L型的敏感性分別為90.9％、94.4％和95.0％，特異性分別為97.4％、93.0％和100

7、.0％;檢測-221位點(diǎn)Y/Y型和Y/X型的敏感性為84.8％和100.0％，特異性為100.0％和85.1％；對檢測5'UT+4位點(diǎn)P和Q型的敏感性和特異性差。(2)206例漢族兒童中啟動(dòng)子區(qū)-550位點(diǎn)H/H、H/L和L/L型分別占57.3％、18.9％和23.8％，H和L型等位基因頻率分別為0.667和0.333；-221位點(diǎn)Y/Y和Y/X型分別占85.4％和14.6％，Y和X型等位基因頻率分別為0.927和0.073；

8、結(jié)論(1)我省漢族兒童MBL基因-550位點(diǎn)、-221位點(diǎn)和+230位點(diǎn)的變異頻率分別為0.333、0.073和0165;5'UT+4位點(diǎn)、+223(52號密碼子)位點(diǎn)和+239位點(diǎn)(57號密碼子)均無突變。(2)我省漢族兒童MBL單體基因型有HYPA、LYPA、LXPA、HYPB、LYPB和LXPB6種，其中以HYPA最多見；新發(fā)現(xiàn)HYPB和LXPB2種單體基因型。 第二部分MBL基因多態(tài)、血漿MBL水平與相關(guān)感染的關(guān)系研究目

9、的研究MBL基因多態(tài)、血漿MBL水平與感染(主要是反復(fù)呼吸道感染)之間的相關(guān)關(guān)系。 研究方法(1)等位基因頻率計(jì)算采用簡單數(shù)基因計(jì)算法，健康組與感染組間MBL基因SNP和基因型頻率比較采用x2檢驗(yàn)。(2)血漿MBL濃度檢測采用ELISA法，人MBLELISA試劑盒為荷蘭HyCultbiotechnology公司產(chǎn)品。(3)組間MBL濃度比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)(秩和檢驗(yàn))。所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS軟件11.0版完成。 結(jié)果(1

10、)由各疾病組組成的感染組與健康組間MBL基因變異頻率比較顯示，感染組-550位點(diǎn)變異頻率明顯高于健康組(0.391vs0.276，x2=6.12，P＜0.05)，但-221和+230位點(diǎn)的變異頻率無顯著性差異。(2)感染組中各疾病組與健康組間比較顯示，RRTI組-550位點(diǎn)和+230位點(diǎn)的變異頻率明顯高于健康組(0.482vs0.276，x2=5.37，P＜0.05；0.254vs0.143，x2=6.17，P＜0.05)，其它組與健康

11、組相比變異頻率無顯著性差異；所有各疾病組-221位點(diǎn)的變異頻率與健康組相比均無顯著性差異。與SNP密切相關(guān)的是MBL單體基因型，RRTI組HYPA的頻率明顯低于健康組(0.509vs0.695，x2=11.02，P＜0.005)而LYPB的頻率高于健康組(0.158vs0.076，x2=5.25，P＜0.05)。(3)健康組(105例)、RRTI組(57例)、ARTI組(21例)、局部膿腫組(13例)和中耳炎組(10例)血漿MBL濃度中

12、位數(shù)分別為1065ng/ml、798ng/ml、1477ng/ml、1707ng/ml和1779ng/ml，各疾病組與健康組血漿MBL濃度比較，ARTI組和局部膿腫組明顯高于健康組，P值分別為0.030和0.021，但RRTI組與健康組相比無顯著性差異(P=0.052)； 結(jié)論(1)RRTI組MBL基因-550位點(diǎn)和+230位點(diǎn)(54位密碼子)的變異頻率顯著高于健康組，相應(yīng)的單體基因型HYPA和LYPA在RRTI組和健康組中的頻

13、率亦有顯著性差異，MBL基因多態(tài)性與RRTI之間存在相關(guān)關(guān)系。(2)低血漿MBL濃度是引起RRTI的一種危險(xiǎn)因素。(3)感染應(yīng)激時(shí)機(jī)體血漿MBL濃度明顯增加，且與恢復(fù)期濃度者呈線性相關(guān)。(4)基因型決定血漿MBL濃度，且外顯子是影響血漿MBL表達(dá)的最關(guān)鍵因素，產(chǎn)物表達(dá)A/A＞A/B＞B/B外顯子；在外顯子相同的情況下，HYP/HYP啟動(dòng)子調(diào)控產(chǎn)物的濃度最高，含變異位點(diǎn)的啟動(dòng)子則較低。 第三部分MBL基因片段的分子克隆和序列分析研

14、究目的進(jìn)一步證實(shí)PCR產(chǎn)物序列分析的分型結(jié)果，確定多位點(diǎn)雜合突變者的單體基因型，并試圖發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)。 研究方法(1)選擇目的DNA片段后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)V-gene公司的DNA快速回收試劑盒純化；(2)分子克隆，采用pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，在Amp板上挑選陽性克隆，快速抽提質(zhì)粒，對確定的重組質(zhì)粒以限制性內(nèi)切酶EcoRV單酶切。(3)序列分析以M13R(-48)為正向測序引物，M13R(-47)為反向測序

15、引物，經(jīng)DNABigDyeMix3730自動(dòng)測序儀進(jìn)行序列分析。(4)將序列分析結(jié)果用dnaman軟件與GeneBank中的人MBL序列分析比較。 結(jié)果(1)PCR產(chǎn)物多次測序?yàn)殡p峰的樣本，分子克隆證實(shí)為相應(yīng)的雜合子；(2)對PCR產(chǎn)物測序提示多位點(diǎn)雜合突變的個(gè)體，確定了突變位點(diǎn)在兩條染色體上的關(guān)系，即明確了其單體基因型。(3)在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了4處新突變位點(diǎn)，-436位點(diǎn)：G→A純合或雜合突變，見于5例RRTI和1例健康者中；-