中藥蘇木和新合成的化學藥對血源性細胞的誘導作用研究.pdf

1、由于工業(yè)化生產(chǎn)造成的環(huán)境污染、人類生活習慣等因素，各種腫瘤發(fā)生率逐年增加。為了尋找低毒、高效的抗癌藥，本文研究了中藥蘇木和化學合成新藥對來源于臍帶血的正常干、祖細胞和血源性的癌細胞的正負調(diào)節(jié)作用，進一步探討其作用于靶細胞的可能機理，并篩選各種生物活性成分的有效濃度如IC50，為臨床治療各種腫瘤及輔助性治療方法提供可靠的實驗依據(jù)。 應用現(xiàn)代細胞培養(yǎng)技術、分子生物學技術、納米技術及免疫標記技術，通過激光共聚焦顯微鏡、透射電子顯微鏡、

2、掃描電鏡、熒光顯微鏡、光學顯微鏡和PCR儀、酶標儀等實驗儀器，研究傳統(tǒng)活血化瘀的中藥蘇木水提物為對來源于臍帶血的單個核細胞向粒系、B系和淋巴系方向分化的正向調(diào)節(jié)作用和對髓系白血病細胞系(K562細胞)的負向調(diào)節(jié)作用；使用近年出現(xiàn)的新劑型-脂質(zhì)體包裹蘇木水提物，來探討細胞內(nèi)給藥的新方法；同時還通過MTT法對200多種化學合成新藥進行活性篩選，研究它們對K562細胞的負調(diào)節(jié)作用。 研究結(jié)果：1.蘇木水提物可以明顯的抑制K562細胞的

3、增殖，各實驗組與空白對照組相比均有差異(P<0.05)，且抑制率與蘇木水提物濃度成顯著的相關性(在24h、48h、72h時r分別為0.90001004、0.984114411和0.973074678)；在48h、100μg/ml時的作用效果最為明顯；當終濃度為25μg/ml時，對細胞增殖的抑制作用與5-Fu(50μg/ml)相當；蘇木脂質(zhì)體能明顯抑制K562細胞的集落形成(與對照組相比*P<0.05)，集落形成數(shù)與藥物濃度呈現(xiàn)負相關(r

4、=0.978)；ID50為129.92μg/ml； 2.蘇木脂質(zhì)體具有誘導K562細胞凋亡的作用：熒光顯微鏡(熒光染色)、普通光學顯微鏡(瑞氏染色)、共聚焦成像、透射電鏡觀察細胞形態(tài)，均發(fā)現(xiàn)細胞核固縮、核碎裂、膜起泡、凋亡小體等各種典型的細胞凋亡形態(tài)的形成，且瑞氏染色和熒光染色的實驗結(jié)果與對照組比較差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，相關性顯著(抑制率與濃度和作用時間之間均有0.9

5、 ladder電泳條帶；流式細胞儀檢測出實驗組有高于對照組5倍的凋亡峰(18.6％：3.1％)；3.RT-PCR實驗證明蘇木脂質(zhì)體誘導凋亡基因p53、Caspase-3、Rb，細胞周期的調(diào)控基因p16，以及具有雙向調(diào)節(jié)作用的特殊基因Bcl-2基因的高表達； 3.原子力顯微鏡、掃描電子顯微鏡檢測自制的磁性熒光納米材料(IFN)平均粒徑為122nm；體外毒性實驗表現(xiàn)為對K562、Hela細胞和小鼠原代骨髓細胞的增殖沒有明顯的抑制作用

6、(p>0.05)；5.蘇木水提物可誘導臍血單個核細胞向粒一單祖細胞(CD33)方向分化：靶細胞在體外培養(yǎng)的7d時，最佳濃度為25μg/ml；靶細胞在體外培養(yǎng)的2.5d、3.5d時，最佳濃度為50μg/ml；在2.5d、3.5d時，細胞陽性率與藥物濃度呈正相關(r=0.9663、0.715526)：6.蘇木水提物可誘導臍血單個核細胞向B系方向分化：靶細胞在體外培養(yǎng)2.5d、3.5d后，各實驗組與對照組相比有差異(p<0.05)，陽性率均高

7、于70％；在培養(yǎng)時間延長到7d，CD19+細胞數(shù)量趨于平緩：50μg/ml處，達到峰值，接近30％；7.蘇木水提物可誘導臍血單個核細胞向淋巴系方向分化：靶細胞在體外培養(yǎng)培養(yǎng)后，在37.5μg/ml的誘導下，2.5d、3.5d時分別到最高點，約88％和92％；CD4的陽性率與藥物濃度之間成顯著正相關(r2.5d=0.9818665，r3.5d=0.8355519)；8.蘇木水提物可誘導造血干細胞(CD117+細胞)向T淋巴細胞(CD4)分

8、化。其峰值為37.5μg/ml，且CD4陽性率隨蘇木濃度的增加而升高(r=0.910386)；9.MTT法對200多種新合成的化學藥進行抗癌活性篩選，發(fā)現(xiàn)其中54多種化合物對K562細胞有明顯地抑制作用，各實驗組與對照組相比有差異(p<0.05)，藥物濃度與抑制率之間成正相關(0.9

9、對照5倍的凋亡細胞的亞二倍體(18.6％:3.1％)，同時流式細胞儀對細胞周期分析表明K562細胞停留在G0-G1期。 結(jié)論：1.蘇木水提物對來源于髓系白血病細胞系K562具有增殖抑制和誘導凋亡作用，其作用機理可能通過影響相關基因(p53基因、bcl-2基因、p16基因、Caspase基因和Rb基因)的表達而實現(xiàn)其抗癌活性。2.蘇木水提物具有誘導臍血單個核細胞向粒一單祖細胞和成熟免疫細胞分化的正向調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)為靶細胞表面膜的分